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의학

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Published: November 24, 2012
doi:
10.3791/4372
, ,
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center,Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center,Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

Summary

방법 중 하나를 사용하여 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 (hDPSCs)의 분리 및 특성 설명<strong펄프> 효소 분해 (DPSC-ED)</strong> 또는<strong펄프 조직 explants에서 줄기 세포> 직접 가지 (DPSC-OG). 그런 다음</strong><em> 체외에서</emodontoblasts에> 비교 차별화.

Abstract

<p class="jove_content"> 개발 사랑니는 일상적인 교정 치료를하여 얻을 수있는 성인 중 줄기 세포의 쉽게 액세스 할 수있는 소스입니다. 인간 펄프 유래 줄기 세포는 (hDPSCs) 성인 줄기 세포의 일반 소스로 비교 멀티 혈통 차별화 용량 높은 확산 가능성을 가지고<sup> 1-8</sup>, 따라서 hDPSCs는 조직 공학 및 재생 의학에서 autologous 이식을위한 좋은 후보자가 될 수 있습니다. 이러한 혜택과 함께, 이러한 immunolodulatory 효과로 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 기능을 가진, 심지어 allograft 이식의 경우, hDPSCs 더 가치가<sup> 6,9,10</sup>. 따라서 줄기 세포의 소스를 사용하기위한 기본 단계는 펄프 조직에서 hDPSCs를 분리에 가장 적합한 프로토콜을 선택하는 것입니다. 이러한 목표를 달성하기 위해서는, 이러한 공통의 표면 마커 및 또한 차별화 능력 등 다양한 세포 행동에 다양한 절연 조건의 효과를 조사하기 위해 매우 중요합니다.</p><p class="jove_content"> 따라서, 우리가 영향을 셋째 어금니 치아에서 인간의 펄프 조직을 분리하고 분리 hDPSCs을위한 문학을 바탕으로 기존의 프로토콜 모두를 사용<sup> 11-13</sup><em> 즉,</em조직> 효소 펄프 조직의 분리 (DPSC-ED) 또는 가지 (DPSC-OG). 이있어서, 우리는 치과 다이아몬드 디스크를 사용하여 절연 방법을 용이하게하려고했습니다. 그런 다음,이 세포는 CD146 있으며, STRO-1과 같은 stromal – 관련 마커 (CD73, CD90, CD105 및 CD44), 조혈 / 내피 마커 (CD34, CD45 및 CD11b), perivascular 마커의 측면에서 특징. 그 후,이 두 프로토콜은 정량 중합 효소 연쇄 반응 (QPCR) 및 알리자린 레드 얼룩 모두에 의해 odontoblasts에 차별화의 효력에 따라 비교했다. QPCR은 mineralization 관련 유전자의 표현 (; 알프, 매트릭스 세포 phosphoglycoprotein, MEPE 및 상아질 sialophosphoprotein, DSPP 알칼리성 인산 가수 분해 효소)의 평가를 위해 사용되었습니다.<sup> 14</sup</p>

Introduction

줄기 세포는 멀티 효력과 자기 갱신 15 두명의 놀라운 기능을 가지고 clonogenic 세포입니다. 다른 replicative의 potencies 모든 줄기 세포 중에서 출생 후의 줄기 세포와 같은 치과 줄기 세포 때문에 자신의 접근성, 소성 및 기타 성인 줄기 세포 16에 비해 높은 proliferative 능력의 최근 관심을 모으고있다. 특질 상, 중간 엽 줄기 세포와 유사한, 치과 펄프의 줄기 세포는 여러 차별화를 mesenchyme로 용량 및 / 또는 체외 및 생체에서 모두 비 mesenchyme lineages을 가지고 자기편 clonogenic 세포입니다. 1-8,17,18 DPSCs에 의해 식별됩니다 자신의 부정적인 조혈 항원의 표현 (예를 들어, CD45, CD34, CD14) 및 CD90의 긍정적 인 표현, CD29, CD73, CD105, CD44 및 STRO-1. 19,20

최소 통증 및 병적 쉽게 얻을 가능성이 valu로 인간 DPSCs을MSCS의 수 출처는 골수 중간 엽 줄기 세포 21로 보통 소스에 비해. 일반적으로 DPSCs는 두 가지 방법, 즉 펄프 조직 explants (DPSC-OG) 22-24과 /이나 효소 소화 (DPSC-ED) 4,6,25에 의한 줄기 세포의 이동에 의해 격리되었습니다. 이전 연구는 격리 방법과 문화 조건 체외 통로 26,27의 아래에 다른 인구 나 lineages을 일으킬 수 것으로 나타났습니다. 영구 치아 (pDPSCs)의 경우, 황 외이 효소 소화 pDPSCs이 강해 DPSCs에 비해 높은 확산 가능성이있는 것으로 밝혀졌습니다. 또한 26, 낙엽 치아 (dDPSCs)의 경우,이 입증 된 그 STRO-1 & CD34 마커 dDPSC-OG에 비해 dDPSC-ED에 더 많은 표현. 또한, dDPSC-ED는 정의 osteo / odonto 매체에 높은 mineralization 속도를 표시. 따라서 27으로 인해 연구에서 DPSCs의 뛰어난 잠재력egenerative 약을 더 연구는 서로 다른 분리 방법에서 파생됩니다 가능한 다양한 인구를 더 잘 이해해야합니다.

여기, 펄프 추출의 과정을 촉진 한 단계 치과 다이아몬드 디스크를 사용하여, 펄프 추출의 쉬운 방법을 소개하려고했습니다. 또한, ED 또는 OG 방법을 적용하여 인간의 펄프 – 파생 줄기 세포의 분리 후, 두 그룹 사이의 일반적인 특성 및 차별화 용량도 조사했다.

Protocol

1. 효소 솔루션 및 확산 매체 (PM)를 준비 Collagenase 종류 나 솔루션을 만들기 : collagenase 유형 I (12 MG / ML)을 무게 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 1 ML PBS와 필터에 용해. 그런 다음 15 ML 튜브를 삽입하고 필요 할 때까지 -20 ° C에 보관하십시오. dispase 솔루션을 확인합니다 dispase을 펴라 (16 MG / ML) 1 ML PBS 및 필터는 0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여 분해. 그런 다?…

Representative Results

효소 분해 (DPSC-ED)에 의해 획득 된 DPSCs는 하루에 10 15,18 (그림 1)에서 여기에 표시됩니다. 분리 한 후 거의 3-5일에 형성 시작 식민지가. 능가 DPSCs (DPSC-OG)는 5 일, 10, 13 & 18 일 그림 2에 표시됩니다. 세포가 병렬 심는 후 약 5 일까지 주문에 의해 펄프 조직에서 병으로 마이그레이션하기 시작 섬유 아세포과 같은. 두 방법을 사용하여 통로 3 DPSCs은 그림 3에 표시됩니…

Discussion

이 프로토콜은 두 가지 방법, 효소 분해 및 펄프 조직 explants에서 줄기 세포를 직접 가지를 사용하여 치과 펄프에서 hDPSCs의 절연 및 특성화 과정을 설명합니다. 또한, odontoblasts에 이러한 세포의 체외 차별화에 정량 알리자린 레드 S 검정 & QPCR에 의해 평가되었다.

인간의 치아에서 펄프 조직을 분리에 대한 기존 프로토콜은 이러한 플라이어 (뼈 포셉) 9 근절 바늘 2…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 굉장히 자신의 기술 지원에 대한 자신의 중요한 원반 씨 모하마드 레자 Khadem 샤리프에 박사 라일라 Shakeri 및 박사 Aref Dournaei을 인정합니다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue or Lot. number Comments (optional)
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS) HyClone SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
L-glutamine GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra Sigma G9422-100G
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control BD pharmingen 50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control BD pharmingen 559532
FITC mouse IgG1 κ isotype BD pharmingen 11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 BD pharmingen 341071
PE anti-human CD146 BD pharmingen 550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC Daka 00034418
PE mouse anti-human CD73 BD pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD pharmingen FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 BD pharmingen 5553888
CD44 PE mouse anti human BD pharmingen 555479
Phosphate buffer Solution (PBS) GIBCO 003000
70-μm cell strainer Falcon 352360
0.2 μm syringe filter Millex-GV SLGV033RB
25 cm2 culture flask Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
multiskan microplate spectrophotometer Thermo scientific 51119200
Fleurcense Microscope Olympus
Flowing Software version 2.3.1
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Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).
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