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의학

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Published: November 24, 2012
doi:
10.3791/4372
, ,
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center,Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center,Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

Summary

のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法<strongパルプ>酵素的解離（DPSC-ED）</strong>または<strong歯髄組織外植片からの幹細胞の>直接伸長（DPSC-OG）。その後に続く</strong><em> in vitroで</em象牙芽細胞へのhDPSCs両方のタイプの>比較分化。

Abstract

<p class="jove_content"開発>親知らずはルーチン矯正治療によって得られることが成人期に幹細胞の容易にアクセス可能なソースです。ヒト歯髄由来幹細胞（hDPSCs）成体幹細胞の通常のソースと比較して多系統分化能力と高い増殖能力を持っている<sup> 1月8日</sup>ので、hDPSCsは、組​​織工学や再生医療における自家移植のための良い候補である可能性があります。これらの利点に加えて、そのようなimmunolodulatory効果などの間葉系幹細胞（MSC）の機能を有するも、同種移植の場合には、hDPSCsがより貴重作る<sup> 6,9,10</sup>。そのため、幹細胞のこのソースを使用する主なステップは、歯髄組織からhDPSCsを単離するための最適なプロトコルを選択することです。この目標を達成するためには、そのような彼らの一般的な表面マーカー＆またそれらの分化能など異なる細胞行動、上の様々な分離条件の影響を調査することが重要です。</p><p class="jove_content">このように、ここで我々は影響を受け第三大臼歯歯からヒト歯髄組織を分離し、次にhDPSCsを単離するための文献に基づいて、両方の既存のプロトコルを使用し、<sup> 11月13日</sup><em>すなわち</em組織外植片から>酵素歯髄組織の解離（DPSC-ED）または伸長（DPSC-OG）。これに関しては、我々は、歯科ダイヤモンドディスクを使用して単離法を容易にしようとしました。次に、これらの細胞はCD146ともSTRO-1のような間質関連マーカー（CD73、CD90、CD105、CD44＆）、造血/内皮細胞マーカー（CD34、CD45及びCD11bを）、血管周囲のマーカーで特徴付け。その後、これらの2つのプロトコルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（QPCR）＆アリザリンレッド染色の両方による象牙芽細胞への分化能に基づいて比較した。 QPCRは、鉱化関連遺伝子の発現（; ALP、マトリックス細胞外リン糖タンパク質; MEPE＆象牙シアロホスホ·タンパク質; DSPPアルカリホスファターゼ）の評価のために使用された。<sup> 14</sup</p>

Introduction

幹細胞は、マルチ効力と自己再生15として知られている2つの顕著な特徴を持っているクローン原性細胞である。異なる複製効力を持つすべての幹細胞のう ​​ち、生後幹細胞などの歯科幹細胞は、それらのアクセシビリティ、可塑性、および他の16の成体幹細胞と比較して高い増殖能力を近年注目を集めている。特徴的には、間葉系幹細胞と同様に、歯髄幹細胞は、複数の分化間充織に能力および/ ​​または in vitro および in vivo の両方において非間葉系統を持って付着クローン原性細胞である。1-8,17,18 DPSCsが特定される彼らの造血抗原の陰性発現（ 例えば 、CD45、CD34、CD14）、およびCD90、CD29、CD73、CD105、CD44およびSTRO-1の陽性発現。19,20

最小痛み＆罹患率との容易な得られた電位は貴重として人間DPSCsを作るMSCのできる源は、骨髄間葉系幹細胞21として普通のソースに比べて。一般的に、DPSCsは伸長法、 すなわち 、歯髄組織外植片からの幹細胞の遊走（DPSC-OG）22から24、および/ ​​または酵素消化によって（DPSC-ED）の4,6,25のいずれかの方法で単離されている。これまでの研究では、単離法と培養条件は 、in vitro の通路26,27 内で異なる集団または系統を誘導できることが示されている。永久歯（pDPSCs）の場合では、Huang らは、酵素消化pDPSCsが手狭DPSCsに比べて高い増殖能力を持っていることを明らかにした。また26は 、乳歯（dDPSCs）の場合、それが実証されたそのSTRO-1とCD34マーカーはdDPSC-OGと比較してdDPSC-EDの続きを表明した。また、dDPSC-EDは、定義された骨/ odonto培地で高い無機化速度が表示されていましたので27によりrのDPSCsの傑出した電位にegenerative薬は、より多くの研究は、異なる分離方法に由来している可能性のある様々な集団をよりよく理解するために必要となります。

ここでは、パルプ抽出のプロセスを容易にするためのワンステップデンタルダイヤモンドディスクを使用することにより、パルプ抽出の簡単な方法を紹介する試みであった。また、EDまたはOGの方法を適用することにより、ヒト歯髄由来幹細胞を単離した後、両群間の一般的なプロパティと分化能についても検討した。

Protocol

1。酵素溶液及び増殖培地（PM）を準備 コラゲナーゼI型溶液を作る：コラゲナーゼI型（12 mg / ml）を秤量し、0.2μmのシリンジフィルターを用いて1mlのPBSとフィルターで溶解する。それを15 mlチューブを配置し、必要になるまで-20℃で保管してください。 ディスパーゼ溶液を作る：ディスパーゼを秤量（16 mg / ml）と1mlのPBSとフィルターが0.2μmのシリンジ?…

Representative Results

酵素的解離（DPSC-ED）により得られたDPSCsは10日、15,18（図1）ここに示されています。分離後約3〜5日に形成するために開始されたコロニーが。 手狭DPSCs（DPSC-OG）は5日、10、13＆18ページの図2に示されています。線維芽細胞様細胞は、平行播種後約5日で注文してフラスコに歯髄組織から移行し始めた。 両方の方法を使用して通路3でDPSCsを図3に示します。DPSCs</…

Discussion

このプロトコルは、2つの方法、酵素的解離と歯髄組織外植片からの幹細胞の直接の伸長を用いて歯髄からhDPSCsの単離および特性のプロセスについて説明します。また、象牙芽細胞へのこれらの細胞のインビトロ分化に 、定量的なアリザリンレッドS＆QPCRアッセイにより評価した。

人間の歯から歯髄組織を分離するための既存のプロトコルは、プライヤー（?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は感謝し、彼の技術的支援のための彼らの重要な議論とモハマド·レザ·カデムシャリフ博士のレイラShakeri＆博士アレフDournaeiを認める。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue or Lot. number Comments (optional)
α-MEM GIBCO 11900-073
Collagenase type I Sigma-Aldrich C0130-100MG
Dispase GIBCO 17105-041
Penicillin/streptomycin GIBCO 15140-122
Amphotericin B GIBCO 15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS) HyClone SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960-5G
L-glutamine GIBCO 25030-024
Dexamethasone Sigma D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra Sigma G9422-100G
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Osteogenesis Assay Kit Millipore PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control BD pharmingen 50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control BD pharmingen 559532
FITC mouse IgG1 κ isotype BD pharmingen 11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 BD pharmingen 341071
PE anti-human CD146 BD pharmingen 550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC Daka 00034418
PE mouse anti-human CD73 BD pharmingen 550257
Anti-h CD105/Endoglin PE BD pharmingen FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1 BD pharmingen 5553888
CD44 PE mouse anti human BD pharmingen 555479
Phosphate buffer Solution (PBS) GIBCO 003000
70-μm cell strainer Falcon 352360
0.2 μm syringe filter Millex-GV SLGV033RB
25 cm2 culture flask Sigma-Aldrich Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur BD 342975
multiskan microplate spectrophotometer Thermo scientific 51119200
Fleurcense Microscope Olympus
Flowing Software version 2.3.1
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References

  1. Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
  2. Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
  3. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
  4. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
  5. Graziano, A., d’Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
  6. Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35 (2008).
  7. Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
  8. Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
  9. Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
  10. de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
  12. Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
  13. Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
  14. Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
  15. Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
  16. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
  17. Graziano, A., et al. Scaffold’s surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
  18. d’Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
  19. Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
  20. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
  21. Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
  22. Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
  23. About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
  24. Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
  25. Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
  26. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
  27. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
  28. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61 (2010).
  29. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
  30. d’Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
  31. Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).

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Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods. J. Vis. Exp. (69), e4372, doi:10.3791/4372 (2012).
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