Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Summary

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door ofwel<strong> Enzymatische dissociatie van pulp (DPSC-ED)</strong> Of<strong> Directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG). Gevolgd door</strong><em> In vitro</em> Vergelijkende differentiatie van beide soorten hDPSCs in odontoblasts.

Abstract

<p class="jove_content"> Ontwikkeling verstandskiezen zijn gemakkelijk toegankelijke bron van stamcellen in de volwassenheid die kunnen worden verkregen door routine orthodontische behandeling. Human pulp-afgeleide stamcellen (hDPSCs) bezit zijn van hoge proliferatie potentieel met multi-lijn differentiatie capaciteit te vergelijken met de gewone bron van volwassen stamcellen^{1 tot 8}, Daarom hDPSCs zou kunnen zijn van de goede kandidaten voor autologe transplantatie in de tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Naast deze voordelen, bezit de mesenchymale stamcellen (MSC) functies, zoals immunolodulatory effect maken hDPSCs waardevoller, zelfs bij allograft transplantatie^6,9,10. Daarom is de eerste stap voor het gebruik van deze bron van stamcellen is het selecteren van de beste protocol voor het isoleren van hDPSCs pulpa. Om dit doel te bereiken, is het cruciaal om het effect van verschillende isolatie omstandigheden onderzoeken op verschillende cellulaire gedrag, zoals hun gemeenschappelijke oppervlaktemerkers en ook de differentiatiecapaciteit.</p><p class="jove_content"> Zo, hier zijn we scheiden de menselijke pulpa van invloed derde molaar tanden, en vervolgens gebruikt zowel bestaande protocollen gebaseerd op literatuur, voor het isoleren van hDPSCs,^{11 tot 13}<em> Dat wil zeggen</em> Enzymatische dissociatie van pulpa (DPSC-ED) of uitgroei van weefselexplantaten (DPSC-OG). In dit gebied, hebben we geprobeerd om het isolement van methoden met behulp van tandheelkundige diamant schijf. Dan deze cellen gekarakteriseerd in termen van stroma-geassocieerde merkers (CD73, CD90, CD105 en CD44), hematopoëtische / endotheliale Markers (CD34, CD45 en CD11b), perivasculaire marker, zoals CD146 en STRO-1. Daarna werden deze twee protocollen vergeleken op basis van de differentiatie in potentie odontoblasts van kwantitatieve polymerase ketenreactie (QPCR) en Alizarin kleuring. QPCR werden gebruikt voor de beoordeling van de expressie van de mineralisatie-gerelateerde genen (alkalische fosfatase, ALP, extracellulaire matrix phosphoglycoprotein; MEPE en dentine sialophosphoprotein; DSPP).<sup> 14</sup</p>

Introduction

Stamcellen zijn cellen die klonogene twee opmerkelijke eigenschappen, bekend als multi-potentie en zelfvernieuwing ¹⁵ bezitten. Van alle stamcellen met verschillende replicatieve vermogens, hebben tandheelkundige stamcellen als postnatale stamcellen gewezen laatste jaren vanwege hun toegankelijkheid, plasticiteit en hoge proliferatieve vermogen in vergelijking met andere volwassen stamcellen ^16. Kenmerkend vergelijkbaar met de mesenchymale stamcellen, dentale pulp stamcellen zijn hechtende klonogene cellen die meerdere differentiatiecapaciteit in mesenchym en / of niet-mesenchym lineages, zowel in vitro als in vivo. ^1-8,17,18 DPSC's worden geïdentificeerd door hun negatieve uitdrukking van hematopoietische antigenen (bijv. CD45, CD34, CD14), en positieve uitdrukking van CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 en STRO-1. ^19,20

Gemakkelijk verkregen potentieel met een minimum aan pijn en ziekte te maken menselijke DPSC's als een waardevollekunnen bron van MSCs in vergelijking met de gewone bronnen, zoals beenmerg mesenchymale stamcellen ^21. In het algemeen zijn DPSC's zijn geïsoleerd door een uitwas werkwijze, dwz migratie van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) ^22-24, en / of door enzymatische digestie (DPSC-ED) ^4,6,25. Eerdere studies hebben aangetoond dat de isolatiemethode en kweekomstandigheden kunnen verschillende populaties of geslachten er onvoldoende in vitro passages ^26,27. In geval van blijvende tanden (pDPSCs), Huang et al. toonde aan dat enzymatische digestie pDPSCs hogere proliferatie potentie vergeleken met de ontgroeid DPSC's. ²⁶ Bovendien, in het geval van melktanden (dDPSCs), werd aangetoond dat STRO-1 en CD34 markers, uitgedrukt in dDPSC-ED in vergelijking met dDPSC-OG. Bovendien dDPSC-ED weergegeven hogere mineralisatie in bepaalde osteo / odonto medium. ²⁷ Derhalve dankzij de uitstekende mogelijkheden van DPSC's in regenerative geneeskunde, meer studies nodig voor een beter begrip van mogelijke verschillende populaties die zijn afgeleid van verschillende isolatiemethoden.

Hier was poging makkelijke manier pulp extractie voeren, met eentraps tandheelkundige diamantschijf de pulp extractie te vergemakkelijken. Bovendien, na isolatie van humane pulp-stamcellen door toepassing of ED OG werkwijzen werden algemene eigenschappen en differentiatiecapaciteit tussen twee groepen onderzocht.

Protocol

1. Bereid de enzymoplossing en proliferatie Medium (PM) Merk Collagenase Type I oplossing: Weeg collagenase type I (12 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met een 0,2 urn spuitfilter. Plaats dan het 15 ml tube en bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is. Maak dispase Oplossing: Weeg dispase (16 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met behulp van een 0,2 micrometer spuitfilter. Plaats dan het 15 ml buis en houd het bij 4 ° C totdat het nodig is. <l…

Representative Results

DPSC's die zijn verkregen door enzymatische dissociatie (DPSC-ED) hier op dag 10, 15,18 (Figuur 1). Kolonies opgestart om op bijna 3 tot 5 dagen na de isolatie vormen. Ontgroeid DPSC's (DPSC-OG) zijn weergegeven in Figuur 2 op dag 5, 10, 13 en 18. Fibroblastachtige cellen begon te migreren van pulp weefsel in de kolf parallel bestellen met bijna 5 dagen na uitzaaien. DPSC's bij passage 3 met beide methoden zijn weergegeven in figuur 3. Beide DPSC's b…

Discussion

Dit protocol beschrijft het proces van isolatie en karakterisering van hDPSCs van tandheelkundige pulp met behulp van twee methoden, enzymatische dissociatie en directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten. Bovendien in vitro differentiatie van deze cellen naar odontoblasts, werd bepaald door kwantitatieve assay Alizarinerood S & QPCR.

Bestaande protocollen voor het isoleren van pulp weefsel van menselijke tand werd gebruik gemaakt van verschillende instrumenten z…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue or Lot. number	Comments (optional)
α-MEM	GIBCO	11900-073
Collagenase type I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dispase	GIBCO	17105-041
Penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
Amphotericin B	GIBCO	15290-018
Fetal Bovine serum defined (FBS)	HyClone	SH30070.03
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960-5G
L-glutamine	GIBCO	25030-024
Dexamethasone	Sigma	D4902
β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Osteogenesis Assay Kit	Millipore	PS01802031
Mouse IgG2b-PE isotype control	BD pharmingen	50808088029
FITC mouse IgG2b isotype control	BD pharmingen	559532
FITC mouse IgG1 κ isotype	BD pharmingen	11471471
FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anti-human CD146	BD pharmingen	550315
Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC	Daka	00034418
PE mouse anti-human CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105/Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
PE mouse anti-human CD11b/Mac1	BD pharmingen	5553888
CD44 PE mouse anti human	BD pharmingen	555479
Phosphate buffer Solution (PBS)	GIBCO	003000
70-μm cell strainer	Falcon	352360
0.2 μm syringe filter	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 culture flask	Sigma-Aldrich	Z707481
			EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan microplate spectrophotometer	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Olympus
Flowing Software version 2.3.1