Dissection, תרבות וניתוח של<em> Xenopus laevis</em> רקמת רשתית עוברית

Summary

Xenopus laevis מספק מערכת מודל אידיאלית ללימוד מפרט גורל תא ותפקוד פיסיולוגי של תאי רשתית בודדים בתרבית תאים ראשוניות. כאן אנו מציגים טכניקה לביתור רקמות רשתית ויצירת תרביות תאים ראשוניות שהם צלמו לפעילות הסידן ונותחו על ידי כלאה באתר.

Abstract

התהליך שבו האזור הקדמי של הצלחת העצבית מעורר רשתית החוליות ממשיך להיות מוקד עיקרי של מחקר קליני ובסיסי. בנוסף לרלוונטיות הרפואיות הברורות להבנה וטיפול במחל רשתית, הפיתוח של רשתית החוליות ממשיך לשמש כמערכת מודל חשובה ואלגנטית לנחישות הבנה עצבית תא סוג ובידול ^1-16. הרשתית העצבית מורכבת משישה סוגים בדידים תא (גנגליון, photoreceptors amacrine, אופקי, תאים דו קוטביים, ותאי גליה מולר) מסודרים בשכבות סטריאוטיפיות, דפוס הנשמר במידה רבה בין כל החוליות ^12,14-18.

בעוד לומד רשתית בעובר מתפתח בשלמות נדרשה באופן ברור להבנה כיצד האיבר המורכב הזה מתפתח מבליטה של ​​המוח הקדמי למבנה שכבתי, ישנן שאלות רבות שתועלנה לכאן ולכאןמ העסקת גישות באמצעות תרבית תאים ראשוניות של תאי רשתית משוערים ^7,19-23. לדוגמה, ניתוח תאים מרקמות שהוסרו וניתקו בשלבים שונים מאפשר לאדם להבחין במצב של מפרט של תאים בודדים בשלבי התפתחות שונים, כלומר, גורלם של התאים בהיעדר אינטראקציות עם רקמות שכנות ^{8,19-22 ,24-33.} תרבית תאים עיקרית גם מאפשרת לחוקר לטיפול בתרבות עם חומרים כימיים מסוימים ולנתח את התוצאות ברמת תא בודדה ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, מערכת מודל קלסית ללימוד התפתחות עצבית מוקדמת ^{19,27,29,31-32,40-42,} משמשת כמערכת מתאימה במיוחד לתרבות הראשונית של תאי רשתית ^10,38,43-45.

רקמת רשתית משוערת היא נגישה מהשלבים המוקדמים של פיתוח, מייד לאחר השראה עצבית ^25,38,43. בנוסף, ניתן הבכל תא בעובר מכיל אספקה ​​של חלמון, תאי רשתית יכולים להיות מתורבתים בטכניקה פשוטה מאוד שהוגדרה בהיקף של תמיסת מלח שנאגר, וכך להסיר את ההשפעות המבלבלות של דגירה או מוצרים אחרים המבוססים על סרום ^10,24,44-45 .

עם זאת, הבידוד של רקמת הרשתית מרקמות סובבות ועיבוד שלאחר מכן מאתגר. כאן, אנו מציגים שיטה לנתיחה והניתוק של תאי רשתית בXenopus laevis שישמשו להכנת תרביות תאים ראשוניות שיהיו, בתורו, להיות מנותחים לפעילות הסידן וביטוי גנים ברזולוציה של תאים בודדים. בעוד הנושא שהוצג במאמר זה הוא הניתוח של הארעיים סיד ספונטניים, הטכניקה היא רחב ישימה למגוון רחב של שאלות מחקר וגישות (איור 1).

Protocol

כל הניסויים שבוצעו בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי הוועדה השתמש במכללת ויליאם ומרי. שלבי התפתחות הפניה בפרוטוקול זה הם על פי Nieuwkoop ופייבר 46. 1. בתור …

Representative Results

דוגמאות לשלפוחית ​​נתחה בהצלחה אופטית (שלב 25) ורשתיות עיניים (שלב 35) מוצגות באיורי 2E וי 2. בעוד שניתן להשתמש בפרוטוקול זה בשלבים שונים של פיתוח, זה הוא קריטי להשגת רקמת רשתית רק כדי להבטיח דיוק לניסויים נוספים. מוציא בזהירות את האפידרמיס בכל השלבים ולהבטיח כי…

Discussion

עם סוגי תאים המאופיינים היטב הנשמרים לאורך כל החוליות, הרשתית מספקת מודל שימושי לחקר התהליכים מולקולריים התאיים המסדירים מפרט ובידול סוג תא. תרבית תאים ראשונית מקנה שיטה רבה עצמה לחקר מגוון רחב של תהליכים, כולל ביטוי גנים, דינמיקת חלבון וסידן ופעילות חשמלית ברמת רזו…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.