Dissection, культуры и анализ<em> Xenopus Хепориз</em> Эмбриональные ткани сетчатки

Summary

Xenopus Хепориз обеспечивает идеальную модельную систему для изучения клетки спецификации судьбы и физиологические функции отдельных клеток сетчатки в первичной культуре клеток. Здесь мы представляем технику для рассечения тканей сетчатки и формирования первичных культур клеток, что загружаются кальция деятельности и проанализированы в гибридизация.

Abstract

Процесс, при котором передней части нервной пластинки приводит к сетчатке позвоночных продолжает оставаться одним из основных направлений клинических и фундаментальных исследований. В дополнение к очевидной медицинской значение для понимания и лечения заболевания сетчатки, развитие позвоночных сетчатки продолжает служить важным и элегантная модель системы для понимания нейронных определения типа и дифференцировки клеток ^1-16. Нейронных сетчатка состоит из шести отдельных типов клеток (ганглии, амакринные, горизонтальные, фоторецепторы, биполярные клетки, а клетки глии Мюллера), расположенных в стереотипных слои, шаблон, который в значительной степени сохраняется среди всех позвоночных ^12,14-18.

При изучении сетчатки в неповрежденной развивающегося эмбриона явно необходимы для понимания того, как это сложный орган развивается из выпячивания мозга в слоистую структуру, есть много вопросов, которые приносят сюдам применения подходов с использованием первичной культуры клеток предполагаемого клеток сетчатки ^7,19-23. Например, анализ клеток из тканей удаляется и диссоциированных на различных этапах позволяет выявить состояние спецификация отдельных клеток на разных стадиях развития, то есть, судьба клеток в отсутствие взаимодействия с соседними тканями ^{8,19-22 ,24-33.} Первичные культуры клеток также позволяет следователю относиться к культуре специфических реагентов и анализировать результаты на одном уровне клетки ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus Хепориз, классическая модель системы для изучения раннего развития нервной ^{19,27,29,31-32,40-42,} служит особенно подходящей системой для сетчатки первичной культуре клеток ^10,38,43-45.

Фиксированные ткани сетчатки доступна с самых ранних стадиях развития, сразу после нейронной индукции ^25,38,43. Кроме того, учитывая йв каждой ячейке в эмбрион содержит поставку желток, клетки сетчатки можно культивировать в очень простой определены сред, состоящих из буферного солевого раствора, удаляя при этом смешанное воздействие инкубации сыворотки или других продуктов на основе ^10,24,44-45 .

Тем не менее, изоляция ткани сетчатки от окружающих тканей и последующая обработка является сложной задачей. Здесь мы представляем метод для вскрытия и диссоциации клеток сетчатки в Xenopus Хепориз, который будет использоваться для подготовки первичных культур клеток, что, в свою очередь, быть проанализированы на активность кальция и экспрессии генов при разрешении отдельных клеток. В то время как темы, представленные в этой работе является анализ спонтанной переходных кальция, техника широко применима к широкому кругу вопросов исследования и подходы (рис. 1).

Protocol

Все эксперименты проводятся следующие протоколы утвержденные Институциональные уходу и использованию животных комитета в Колледже Уильяма и Мэри. Стадии развития, указанные в данном протоколе в соответствии с Nieuwkoop и Фабера 46. 1. Диссекция Разрешить среду к…

Representative Results

Примеры успешного расчлененный глазные пузыри (этап 25) и сетчатки (этап 35), показаны на рисунках 2E и 2J. Хотя этот протокол может быть использован на различных этапах развития, очень важно получить только ткани сетчатки, чтобы обеспечить точность для дальнейших экспери?…

Discussion

Благодаря хорошо изученных типов клеток, которые сохраняются во всех позвоночных животных, сетчатка представляет собой полезную модель для изучения молекулярно-клеточные процессы, определяющие ячейки спецификации типа и дифференциации. Первичные культуры клеток дает мощный метод и…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.