Disseksjon, kultur, og analyse av<em> Xenopus laevis</em> Embryonic Retinal Tissue

Summary

Xenopus laevis gir en ideell modell system for å studere cellen skjebne spesifikasjon og fysiologiske funksjon av individuelle netthinnens celler i grunnskolen cellekultur. Her presenterer vi en teknikk for å dissekere retinal vev og generere primære cellekulturer som er avbildet for kalsium aktivitet og analysert ved in situ hybridisering.

Abstract

Den prosessen som den fremre delen av nevrale plate gir opphav til virveldyr netthinnen fortsetter å være et stort fokus på både klinisk og grunnleggende forskning. I tillegg til de åpenbare medisinsk relevans for å forstå og behandle retinal sykdom, fortsetter utviklingen av virveldyr netthinnen å tjene som et viktig og elegant modellsystem for forståelse neuronal celletype bestemmelse og differensiering ^1-16. Det nevrale netthinnen består av seks diskrete celletyper (ganglion, amacrine, horisontal, fotoreseptorer, bipolare celler, og Muller gliacellene) ordnet i stereotype lag, et mønster som er i stor grad bevart blant alle virveldyr ^12,14-18.

Mens han studerte netthinnen i intakt utvikling av embryo er klart nødvendig for å forstå hvordan dette komplekse organ utvikler seg fra en utvekst av forebrain inn en lagdelt struktur, er det mange spørsmål som er til fordel from ansette tilnærminger med primær cellekultur av presumptive netthinnens celler ^7,19-23. For eksempel, å analysere celler fra vev fjernet og dissosiert på forskjellige stadier tillater en å skjelne staten spesifikasjonen av individuelle celler på ulike utviklingsstadier, dvs. skjebnen av cellene i fravær av interaksjoner med nærliggende vev ^{8,19-22 ,24-33.} Primære cellekulturer kan også etterforsker for å behandle kultur med spesifikke reagenser og analysere resultatene på en enkelt celle nivå ^{5,8,21,24,27-30,33-39.} Xenopus laevis, en klassisk modell system for studiet av tidlig nevral utvikling ^{19,27,29,31-32,40-42,} fungerer som en spesielt egnet system for retinal primære cellekulturer ^10,38,43-45.

Presumptive retinal vev er tilgjengelig fra de tidligste stadiene av utviklingen, umiddelbart etter nevrale induksjon ^25,38,43. I tillegg gis thved hver celle i embryoet inneholder en tilførsel av eggeplomme, kan netthinnens celler dyrkes i en svært enkel definerte medier bestående av en bufret salt-løsning, og dermed fjerne forstyrrende effekter av inkubering eller andre sera-baserte produkter ^10,24,44-45 .

Imidlertid er isolasjon av retinal vev fra omkringliggende vev og påfølgende behandling utfordrende. Her presenterer vi en fremgangsmåte for disseksjon og dissosiasjon av netthinnens celler i Xenopus laevis som skal anvendes for å fremstille primære cellekulturer som vil, i sin tur, blir analysert for kalsium aktivitet og genekspresjon på oppløsningen av enkeltceller. Mens temaet presenteres i denne artikkelen er analysen av spontane kalsium transienter, er teknikken bredt gjeldende for et bredt spekter av problemstillinger og tilnærminger (figur 1).

Protocol

Alle eksperimenter utføres etter protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved College of William and Mary. Utviklingsstadier refereres til i denne protokollen er i henhold til Nieuwkoop og Faber 46. 1. Disseksjon Tillat cellekulturmediet og kalsium magnesium fritt medium (CMF) å nå romtemperatur. Du vil også trenge 0.1X Marc Modified Ringer (MMR) pH 7.4 til 7.6. Steriliser følgende elementer ved å bruke en UV-lys i 30 minutter i …

Representative Results

Eksempler på vellykket dissekert optikk vesikler (stadium 25) og retinae (stadium 35) er vist i figurene 2E og 2J. Mens denne protokollen kan brukes på ulike stadier i utviklingen, er det avgjørende å få bare retinal vev for å sikre nøyaktighet for nye eksperimenter. Fjern forsiktig epidermis i alle ledd og sikre at tang ikke punktere retinal vev. I stadium 35 eller eldre, kan linsen bli sett på som et klart lag på toppen av netthinnen og kan fjernes ved forsiktig skraping med tang. <p clas…

Discussion

Med sine godt karakterisert celletyper som er bevart på tvers av alle virveldyr, gir netthinnen en nyttig modell for å studere molekylære cellulære prosesser som styrer celletype spesifikasjon og differensiering. Primær cellekultur gir en kraftig metode for å undersøke en rekke prosesser, inkludert genekspresjon, protein dynamikk, og kalsium og elektriske aktiviteten på nivået av enkeltcelle oppløsning. Her presenterer vi en grei teknikk for primær cellekultur fra dissekert presumptive retinal vev i Xenop…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
			For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm	Fisher	08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm	Fisher	0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent)	Fisher	12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55)	Fisher	NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm	Fisher	50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamicin Sulfate	Enzo Life Sciences	380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder	Life Technologies	27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum	Roche	11088831001
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sulfate (optional)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane	Corning	430758
			For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent	Life Technologies	F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water	Life Technologies	P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System	Zeiss	Model Discontinued
Blocking Reagent	Roche	11096176001
			For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3 NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Fluorescein	Thermo Scientific	46409
Formamide, Deionized	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, Type IX	Sigma-Aldrich	R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Solution Reference Contents Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin Adjust pH to 7.8 with HCl. Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter. Store at 4 °C. Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid 150 mM NaCl (pH 7.5). Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH adjusted to 7.4 with NaOH 0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH. MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3.7% formaldehyde A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock). In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparin 1X Denhart’s Solution 0.1% Tween 20 0.1% CHAPS 10 mM EDTA. Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.