जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन के विश्लेषण से एक enzymatic सेल फ्यूजन परख का उपयोग
Summary
हम एक सेल संलयन परख कि β-galactosidase की सक्रिय अभिव्यक्ति जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन घटनाओं quantifies विकसित किया है.
Abstract
जाल (एस एन ethylmaleimide के प्रति संवेदनशील oluble कारक एक ttachment प्रोटीन फिर नाड़ी का अंतिम सिरा) vesicles (v-snares) पर और लक्ष्य झिल्ली पर प्रोटीन की बातचीत (टी Snares) intracellular पुटिका संलयन 1-4 उत्प्रेरित. पुनर्गठन assays तंत्र और जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन 5 के विनियमन विदारक के लिए आवश्यक हैं. एक सेल संलयन परख में 6,7, जाल प्रोटीन ectopically कोशिका की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं. ये जाल प्रोटीन ड्राइव संलयन सेल सेल "रूप से फ़्लिप", प्रदर्शन है कि Snares सेलुलर झिल्ली को फ्यूज करने के लिए पर्याप्त हैं. है क्योंकि सेल में विलय परख सूक्ष्म विश्लेषण पर आधारित है, यह कम कुशल है जब कई v-और टी जाल बातचीत मात्रात्मक विश्लेषण किया.
यहाँ हम एक नया 8 परख कि β-galactosidase की सक्रिय अभिव्यक्ति जाल की मध्यस्थता सेल संलयन घटनाओं quantifies का वर्णन करता है. दोटेट्रासाइक्लिन नियंत्रित (TTA) transactivator और एक प्लाज्मिड पत्रकार कि टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व के नियंत्रण (TRE lacZ) के तहत lacZ जीन encodes: Tet ऑफ जीन अभिव्यक्ति 9 प्रणाली के घटकों के एक readout प्रणाली के रूप में किया जाता है. क्योंकि 7-कोशिकाओं है कि क्योंकि 7-कोशिकाओं है कि कोशिका की सतह पर व्यक्त टी जाल प्रोटीन रूप से फ़्लिप (टी कोशिकाओं) में व्यक्त v-जाल प्रोटीन कोशिका की सतह पर (v-कोशिकाओं) और TRE lacZ transfect रूप से फ़्लिप में हम transfect TTA . V-और TTA TRE, lacZ के transcriptional सक्रियण और β-galactosidase की अभिव्यक्ति करने के लिए बाध्य में टी कोशिकाओं के परिणामों के संलयन जाल पर निर्भर है. β-galactosidase की गतिविधि absorbance 420 एनएम पर वर्णमिति पद्धति का उपयोग करके मात्रा निर्धारित है.
पुटिका से जुड़े झिल्ली प्रोटीन (पिशाचों) v-Snares है कि विभिन्न पद Golgi vesicular डिब्बों में 10-15 रहते हैं. Vamps 1, 3, 4, 5, 7 और 8 में एक ही स्तर पर व्यक्त की, हम उनके झिल्ली संलयन की तुलनागतिविधियों enzymatic सेल संलयन परख का उपयोग कर. Spectrometric माप के आधार पर, इस परख जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन का विश्लेषण करने के लिए और उच्च throughput अध्ययन के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
मूल सेल संलयन 6 परख प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जाल की मध्यस्थता सेल संलयन घटनाओं को निर्धारित करता है. यहाँ हम एक अभिनव परख कि β galactosidase और spectrometric माप सक्रिय अभिव्यक्ति द्वारा जाल की मध्यस्थता स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्टार्टअप धन के द्वारा स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से Louisville और CA135123 के विश्वविद्यालय (CH) से समर्थित है.
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
