Анализ SNARE-опосредованного слияния мембран помощью ферментативного анализа слияния клеток
Summary
Мы разработали анализ слияния клеток, который количественно SNARE-опосредованных событий слияние мембран активированным выражение β-галактозидазы.
Abstract
Взаимодействий SNARE (ы oluble N-этилмалеимид-чувствительных факторов повторного ttachment белком рецептор) белков на пузырьках (V-SNAREs) и на цели мембран (т-SNAREs) катализирует внутриклеточные везикулы слияния 1-4. Восстановление анализы имеют важное значение для рассечения механизмов и регуляции обмена SNARE-опосредованного слияния мембран 5. В анализе слияния клеток 6,7, Малый белки экспрессируются эктопически на поверхности клетки. Эти "перевернул" SNARE белков диск клетка-клетка слияния, демонстрируя, что SNAREs достаточно, чтобы слиться клеточных мембран. Поскольку анализ слияния клеток основана на микроскопическом анализе, он менее эффективен, когда используется для анализа нескольких В-и Т-SNARE взаимодействия количественно.
Здесь мы описываем новую анализа 8, что количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы. ДваКомпоненты Tet-Off экспрессии генов системы 9 используются в качестве считывания системы: тетрациклин-контролируемой трансактиватор (TTA) и репортера плазмиды, который кодирует ген LacZ под контролем тетрациклин-ответ элемент (TRE-LacZ). Мы трансфекции TTA в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернутый V-SNARE белков на поверхности клетки (В-клетки) и трансфекции TRE-LacZ в COS-7 клетки, которые экспрессируют перевернулся T-SNARE белков на поверхности клетки (Т-клетки) . SNARE-зависимых слияние В-и Т-клеток приводит к связыванию TTA, чтобы TRE, транскрипционной активации LacZ и экспрессии β-галактозидазы. Активность β-галактозидазы количественно использованием колориметрическим методом по поглощению при 420 нм.
Пузырька связанных мембранных белков (вампиры) являются V-SNAREs, которые находятся в различных пост-Гольджи везикулярного отсеков 10-15. Выражая 1 вампиров, 3, 4, 5, 7 и 8 на том же уровне, мы сравниваем их слияние мембрандеятельности с использованием ферментативного анализа слияния клеток. На основании спектрометрических измерений этого анализа предлагается количественный подход к анализу SNARE-опосредованного слияния мембран и высокой пропускной исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оригинальный анализ слияния клеток 6 определяет SNARE-опосредованных событий слияние клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь мы опишем инновационного анализа, который количественно SNARE-опосредованных событий слияния клеток активированными выражение β-галактозидазы и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается запуск средств из Университета Луисвилл и CA135123 из Национальных институтов здравоохранения (CH).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalog number |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | |
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
- Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
- Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
- Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
- Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs–engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
- Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
- Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
- Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
- Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs – VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
- Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release – four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
- McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
- Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
- Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
- Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
- Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).
