זיהוי נדיפים חוש ריח באמצעות קלטות כרומטוגרפיה-Multi-יחידת גז (GCMR) באונת מחושי החרקים
Summary
רמזי ריח לתווך התנהגויות רבות ושונות בחרקים, ולעתים קרובות הם תערובות מורכבות מורכבות מעשרות עד מאה תרכובות נדיפות. שימוש בגז כרומטוגרפיה עם הקלטה רבה ערוצית באונת מחושי החרקים, אנו מתארים שיטה לזיהוי של תרכובות ביו.
Abstract
כל היצורים חיים בעולם מלא בגירויים חושיים שקובעים התגובה התנהגותית ופיזיולוגית שלהם לסביבתם. Olfaction חשוב במיוחד בחרקים, המשתמשים במערכות חוש הריח שלהם כדי להגיב, ולהפלות בין גירויי ריח, מורכבים. ריחות אלה לעורר התנהגויות אשר מתווכים תהליכים כגון רבייה ובית גידול בחירת 1-3. בנוסף, חישה כימית על ידי חרקי התנהגויות מתווכות שהם משמעותיים ביותר לחקלאות ולבריאותו של אדם, כוללים האבקה 4-6, תזונה צמחונית של גידולי מזון 7, והעברת מחל 8,9. זיהוי אותות ריח ותפקידם בהתנהגות חרקים כן חשוב להבנת שני תהליכים אקולוגיים ומשאבי מזון אדם ורווחתו.
עד כה, זיהוי נדיפים המניעים את התנהגות חרקים כבר קשה ולעתים מייגע. טכניקות שוטפות כוללותהקלטת גז כרומטוגרפיה מצמידי electroantennogram (GC-EAG), וגז כרומטוגרפיה שילוב הקלטות sensillum יחידות (GC-SSR) 10-12. טכניקות אלה הוכחו כחיוניים בזיהוי של תרכובות ביו. אנחנו פתחנו שיטה שמשתמשת בגז כרומטוגרפיה מצמידה להקלטות אלקטרו מרובים ערוצים (מכונה 'GCMR') מתא העצב באונת המחושים (AL; מרכז ההרחה הראשוני של החרק) 13,14. טכניקה זו מדינה-of-the-art מאפשרת לנו לחקור כיצד מידע ריח מיוצג במוח החרק. יתר על כן, בגלל תגובות עצביות לריחות ברמה זו של עיבוד חוש ריח הן בגלל רגישות גבוהה למידת ההתכנסות של נוירונים הקולטן של האנטנה לנוירונים AL, הקלטות AL תאפשרנה זיהוי של רכיבים פעילים של ריחות טבעיים ביעילות וברגישות גבוהה. כאן אנו מתארים GCMR ולתת דוגמה לשימוש בו.
כמה צעדים כלליים הם involVED בזיהוי של ביו נדיפים ותגובה של חרקים. נדיפים ראשונים צריכים להיות שנאספו ממקורות העניין (בדוגמה זו אנו משתמשים בפרחים מסוג פרח הקוף (Phyrmaceae)) ומאופיין במידת הצורך באמצעות טכניקות הסטנדרטיות GC-MS 14-16. חרקים מוכנים למחקר באמצעות נתיחה מינימאלית, לאחר שחוט רושם מוכנס לתוך אונת מחושים ורבי ערוצי הקלטה עצבית מתחילה. לאחר העיבוד של הנתונים העצביים ואז מגלה שodorants מסוים לגרום לתגובות עצביות משמעותיות על ידי מערכת העצבים של החרקים.
למרות הדוגמא שנציג כאן היא ספציפית למחקרי האבקה, GCMR ניתן להרחיב למגוון רחב של אורגניזמים לימוד ומקורות נדיפים. לדוגמה, בשיטה זו ניתן להשתמש בזיהוי odorants מושך או דוחה חרקים ומזיקי וקטור צומח. יתר על כן, GCMR יכול לשמש גם כדי לזהות משיכה לחרקים מועילים, כגון פוllinators. הטכניקה עשויה להיות מורחבת לנושאים שאינם חרקים, כמו גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
התנהגויות חרקי חוש ריח בתיווך לנהוג תהליכים רבים ושונים, כולל רבייה, בחירת מארח אתר, וזיהוי משאבי מזון המתאימים. חקר התהליכים הללו מחייב את היכולת לזהות את נדיפים הנפלטים מהמקור, כמו גם את היכולת לזהות תרכובות אלו המתווכים את ההתנהגויות. מסבך עניינים הוא שריחות מורכב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF IOS 1121692, ועל ידי אוניברסיטת קרן המחקר של וושינגטון.
Materials
| Name of item | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system – OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software – SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software – Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. . International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 .
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
