Identifikation af olfaktoriske Flygtige stoffer ved hjælp af gaskromatografi-Multi-unit Recordings (GCMR) i Insect Antennal Lobe
Summary
Olfaktoriske stikord medierer mange forskellige adfærd hos insekter, og er ofte komplekse blandinger bestående af snesevis til hundredvis af flygtige forbindelser. Anvendelse af gaskromatografi med flere kanaler optagelse i insekt antennal lap, beskriver vi en fremgangsmåde til identifikation af bioaktive forbindelser.
Abstract
Alle organismer bebor en verden fuld af sensoriske stimuli, der bestemmer deres adfærdsmæssige og fysiologiske respons på deres omgivelser. Lugtesansen er især vigtigt i insekter, som bruger deres olfaktoriske system til at reagere på, og diskriminere blandt, komplekse lugt stimuli. Disse lugte fremkalde adfærd, som medierer processer såsom reproduktion og levesteder udvælgelse 1-3. Derudover kemiske optagelser fra insekter medierer adfærd, der har stor betydning for landbruget og menneskers sundhed, herunder bestøvning 4-6, herbivory af fødevareafgrøder 7, og overførsel af sygdomme 8,9. Identifikation af olfaktoriske signaler og deres rolle i insekt adfærd er således vigtigt for forståelsen både økologiske processer og fødevarer ressourcer og velbefindende.
Hidtil har identifikationen af flygtige stoffer, som driver insekt adfærd været vanskeligt og ofte kedelig. Aktuelle teknikker indbefattergaskromatografi-koblet electroantennogram optagelse (GC-EAG), og gaskromatografi-koblede enkelt sensillum optagelser (GC-SSR) 10-12. Disse teknikker viste sig at være afgørende i identifikationen af bioaktive stoffer. Vi har udviklet en metode, der benytter gaschromatografi koblet til multi-kanal elektrofysiologiske optagelser (benævnt »GCMR«) fra neuroner i antennal lap (AL, insektet primære olfaktoriske center) 13,14. Denne state-of-the-art teknik giver os mulighed for at undersøge hvordan lugt information er repræsenteret i insektet hjernen. Endvidere, fordi neurale reaktioner på lugte på dette niveau af olfaktoriske behandling er meget følsomme på grund af graden af konvergens af antennens receptor neuroner i AL neuroner, vil AL-optagelser tillade påvisningen af aktive bestanddele i naturlige lugte effektivt og med høj følsomhed. Her beskriver vi GCMR og give et eksempel på dets anvendelse.
Adskillige generelle trin er involat the i afsløring af bioaktive flygtige stoffer og insekt respons. Flygtige først skal indsamles fra kilder af interesse (i dette eksempel bruger vi blomster fra slægten Mimulus (Phyrmaceae)) og karakteriseres efter behov ved hjælp af standard GC-MS-metoder 14-16. Insekter er forberedt til studie med minimal dissektion, hvorefter en optagelse elektrode sættes ind i antennal lap og multi-kanal neural optagelse begynder. Post-behandling af de neurale data derefter afslører, hvilke specifikke lugtstoffer medføre betydelige neurale reaktioner fra insektet nervesystemet.
Selvom eksemplet præsenterer vi her er specifikt for bestøvning undersøgelser, kan GCMR udvides til en lang række studier organismer og flygtige kilder. For eksempel kan denne fremgangsmåde anvendes til identifikation af lugtstoffer der tiltrækker eller frastøder insekter og skadedyr i afgrøden. Desuden kan GCMR også anvendes til at identificere tiltrækningsmidler for gavnlige insekter såsom pollinators. Teknikken kan udvides til ikke-insektceller emner også.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insekt lugte-medierede adfærd køre mange forskellige processer, herunder reproduktion, host-site markering, og identifikation af egnede føderessourcer. Undersøgelsen af disse processer kræver evne til at identificere de flygtige udsendes fra kilden, såvel som evnen til at identificere de forbindelser, der medierer den adfærd. Komplicerende forhold er, at lugte består af snesevis til hundredvis af individuelle forbindelser, der tilsammen skaber en unik duft, der opfattes anderledes end de enkelte bestanddel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud IOS 1121692, og ved University of Washington Research Foundation.
Materials
| Name of item | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system – OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software – SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software – Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. . International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 .
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
