Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe
Summary
Olfactorische signalen bemiddelen veel verschillende gedragingen in insecten, en zijn vaak complexe mengsels bestaat uit tientallen tot honderden vluchtige verbindingen. Met gaschromatografie met meerkanaals opname in het insect antennelid lobe beschrijven we een werkwijze voor de identificatie van bioactieve verbindingen.
Abstract
Alle organismen bewonen een wereld vol van zintuiglijke prikkels die hun gedrags-en fysiologische reactie op hun omgeving te bepalen. Reukzin is vooral belangrijk in insecten, die hun olfactorische systemen te reageren op en onder complexe geur stimuli. Deze geuren roepen gedragingen die bemiddelen processen, zoals reproductie en habitat selectie 1-3. Bovendien, chemische detectie door insecten bemiddelt gedragingen die zeer belangrijk zijn voor de landbouw en de menselijke gezondheid, met inbegrip van bestuiving 4-6, herbivorie van voedingsgewassen 7 en overdracht van ziektes 8,9. Identificatie van olfactorische signalen en hun rol in insecten gedrag is dus belangrijk voor het begrijpen van zowel ecologische processen en menselijke voedselbronnen en welzijn.
Tot op heden heeft de identificatie van vluchtige stoffen die insecten gedrag sturen is moeilijk en vaak vervelend. Huidige technieken omvattengaschromatografie gekoppelde electroantennogram opname (GC-EAG), en gaschromatografie gekoppelde enkele sensillen opnamen (GC-SSR) 10-12. Deze technieken bleken vitaal belang in de identificatie van bioactieve verbindingen. We hebben een methode ontwikkeld die gaschromatografie gekoppeld aan multi-channel elektrofysiologische opnamen (aangeduid als 'GCMR') van neuronen in de antennaal kwab (AL; van het insect primaire olfactorische centrum) maakt gebruik van 13,14. Deze state-of-the-art techniek stelt ons in staat om door te dringen hoe geur informatie is vertegenwoordigd in het insect hersenen. Bovendien, omdat neurale respons op geuren op dit niveau van verwerking geur zeer gevoelig vanwege de mate van convergentie van de antenne receptor neuronen in AL neuronen zal AL opnamen de detectie van actieve bestanddelen van natuurlijke geuren efficiënt en met hoge gevoeligheid. Hier beschrijven we GCMR en een voorbeeld geven van het gebruik ervan.
Een aantal algemene stappen zijn INVOLmj in de detectie van bioactieve vluchtige en insecten reactie. Vluchtige stoffen moeten eerst worden verzameld uit bronnen van belang (in dit voorbeeld gebruiken we bloemen uit het geslacht Mimulus (Phyrmaceae)) en gekarakteriseerd als dat nodig is met behulp van standaard GC-MS technieken 14-16. Insecten worden bereid voor onderzoek met minimale dissectie, waarna een registratie-elektrode wordt in de antennelid kwab en meerkanaals neurale opname begint. Post-verwerking van de neurale gegevens blijkt dan welke specifieke geurstoffen belangrijke neurale reacties veroorzaken door het zenuwstelsel van een insect.
Hoewel het voorbeeld we hier specifiek is voor bestuiving studies kunnen GCMR worden uitgebreid met een groot aantal studie organismen en vluchtige bronnen. Zo kan deze methode worden gebruikt bij de identificatie van geurstoffen aantrekken of afstoten vector insecten en plagen. Bovendien kan GCMR ook worden gebruikt om lokstof identificeren voor nuttige insecten zoals pollinators. De techniek kan worden uitgebreid naar niet-insect vakken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insect olfactorische-gemedieerde gedrag rijden veel verschillende processen, waaronder reproductie, host-selectie van locaties, en de identificatie van geschikte voedselbronnen. De studie van deze processen vereist het vermogen om de vluchtige stoffen die uit de bron, en het vermogen om die verbindingen die bemiddelen het gedrag identificeren identificeren. Complicerende zaken is dat geuren bestaan uit tientallen tot honderden verschillende verbindingen die samen een unieke geur die anders wordt ervaren dan de afz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NSF subsidie IOS 1121692, en door de Universiteit van Washington Research Foundation.
Materials
| Name of item | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system – OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software – SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software – Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. . International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 .
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
