Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto
Summary
Pistas olfativas mediar muitos comportamentos diferentes em insetos, e muitas vezes são misturas complexas compostas de dezenas a centenas de compostos voláteis. Utilizando cromatografia em fase gasosa com multi-canais de gravação no lobo antenal inseto, descreve-se um método para a identificação de compostos bioactivos.
Abstract
Todos os organismos habitam um mundo cheio de estímulos sensoriais que determinam a sua resposta comportamental e fisiológica ao seu ambiente. O olfato é especialmente importante em insetos, que utilizam seus sistemas olfativos para responder, e discriminar entre estímulos, odor complexos. Estes odores provocam comportamentos que medeiam processos como a reprodução e seleção de habitat 1-3. Além disso, sensores químicos por comportamentos insetos media que são altamente significativa para a agricultura ea saúde humana, incluindo a polinização 4-6, herbivoria de culturas alimentares 7, e transmissão da doença de 8,9. Identificação de sinais olfativos e seu papel no comportamento dos insetos é, portanto, importante para a compreensão tanto dos processos ecológicos e os recursos alimentares humanos e bem-estar.
Até à data, a identificação de compostos voláteis que dirigem o comportamento de insectos tem sido difícil e tedioso. As técnicas atuais incluemgás de gravação eletroantenogramas cromatografia acoplada (GC-EAG), e cromatografia em fase gasosa acoplada gravações individuais sensillum (GC-SSR) 10-12. Estas técnicas provaram ser vital para a identificação de compostos bioactivos. Nós desenvolvemos um método que usa cromatografia gasosa acoplada a multi-canal registros eletrofisiológicos (denominado «GCMR ') de neurônios no lóbulo antenal (AL; principal centro do inseto olfativas) 13,14. Esta técnica estado-da-arte nos permite investigar como as informações odor é representado no cérebro do inseto. Além disso, porque as respostas neurais aos odores, a este nível de processamento olfactivo são altamente sensíveis devido ao grau de convergência de neurónios da antena do receptor em neurónios AL, AL gravações irá permitir a detecção de constituintes activos de odores naturais de forma eficiente e com elevada sensibilidade. Aqui descrevemos GCMR e dar um exemplo de seu uso.
Várias etapas gerais são envolved na detecção de compostos voláteis bioactivos e da resposta de insectos. Voláteis primeiro precisam ser coletados a partir de fontes de interesse (neste exemplo, usar flores da Mimulus gênero (Phyrmaceae)) e caracteriza-se como necessário, utilizando padrão de GC-MS técnicas 14-16. Os insectos são preparados para o estudo utilizando dissecção mínima, após o qual um eléctrodo de gravação é inserida no lobo antenal e gravação multi-canal neural começa. Pós-processamento dos dados neurais, então, revela que odores particulares causar significativas respostas neurais do sistema nervoso dos insetos.
Embora o exemplo que apresentamos aqui é específico para os estudos de polinização, GCMR pode ser expandida para uma ampla gama de organismos de estudo e de fontes voláteis. Por exemplo, este método pode ser utilizado na identificação de odores para atrair ou repelir insectos vectores e pragas de culturas. Além disso, GCMR também pode ser usado para identificar atractivos para os insectos benéficos, tais como pollinators. A técnica pode ser expandida para indivíduos não-insectos, bem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insetos olfativo mediadas comportamentos conduzir muitos processos diferentes, incluindo a reprodução, host local, seleção e identificação de recursos alimentares adequados. O estudo destes processos requer a capacidade de identificar os voláteis emitidos a partir da fonte, bem como a capacidade de identificar esses compostos, que são mediadoras dos comportamentos. Para complicar as coisas é que os odores são compostas de dezenas a centenas de compostos individuais que, juntos, criam um aroma único que é per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela NSF concessão IOS 1121692, e pela Fundação Universidade de Washington Research.
Materials
| Name of item | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system – OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software – SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software – Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. . International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 .
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
