Identifiering av Olfactory Flyktiga med gaskromatografi-Multi-enhet inspelningar (GCMR) i Insect antenn Lobe
Summary
Olfactory signaler förmedlar många olika beteenden hos insekter, och är ofta komplexa blandningar som består av tiotals till hundratals flyktiga föreningar. Användning gaskromatografi med flerkanaligt inspelning i insekten antenn lob, beskriver vi en metod för identifiering av bioaktiva föreningar.
Abstract
Alla organismer lever i en värld full av sensoriska stimuli som avgör deras beteendemässiga och fysiologiska respons på sin omgivning. Olfaction är särskilt viktigt i insekter, som använder sina lukt system att svara på, och diskriminera bland, komplexa lukt stimuli. Dessa lukter framkallar beteenden som förmedlar processer såsom reproduktion och livsmiljö val 1-3. Dessutom kemiska avkänning av insekter förmedlar beteenden som är mycket betydelsefullt för jordbruk och människors hälsa, inbegripet pollinering 4-6, herbivori av livsmedelsgrödor 7, och överföring av sjukdom 8,9. Identifiering av olfaktoriska signaler och deras roll i insekt beteende är därför viktigt för att förstå både ekologiska processer och mänskliga resurser mat och välbefinnande.
Hittills har identifieringen av flyktiga ämnen som driver insekt beteende varit svårt och ofta tråkiga. Aktuella tekniker inkluderargaskromatografi-kopplad electroantennogram inspelning (GC-EAG) och gaskromatografi-kopplade enkla sensillum inspelningar (GC-SSR) 10-12. Dessa tekniker visade sig vara avgörande för identifieringen av bioaktiva föreningar. Vi har utvecklat en metod som använder gaskromatografi kopplad till flerkanaliga elektrofysiologiska inspelningar (kallas "GCMR ') från nervceller i antenn loben (AL, insekten primära lukt centrum) 13,14. Denna state-of-the-art teknik ger oss möjlighet att undersöka hur lukt information representeras i insekten hjärnan. Dessutom, eftersom neurala svar på lukter på denna nivå av luktsinnet behandling är mycket känsliga på grund av graden av konvergens av antennens receptor neuron i AL nervceller kommer AL inspelningar tillåter detektion av aktiva beståndsdelar i naturliga lukter effektivt och med hög känslighet. Här beskriver vi GCMR och ge ett exempel på dess användning.
Flera allmänna steg är involved vid detektering av bioaktiva flyktiga och insekt respons. Flyktiga ämnen måste först hämtas från källor av intresse (i detta exempel använder vi blommor från släktet Mimulus (Phyrmaceae)) och karakteriseras som behövs med vanliga GC-MS teknik 14-16. Insekter är förberedda för studie med minimal dissektion, varefter en inspelning elektrod förs in i antenn lob och flerkanalig neurala inspelningen börjar. Efterbehandling av de neurala uppgifter avslöjar sedan vilka särskilda doftämnen orsaka betydande neurala reaktioner från insekten nervsystemet.
Även om exemplet som vi presenterar här är specifik för pollinering studier kan GCMR utökas till ett brett spektrum av studier organismer och flyktiga källor. Till exempel, kan denna metod användas vid identifiering av doftämnen locka eller repellerande vektor insekter och skadedjur grödor. Dessutom kan GCMR också användas för att identifiera attraherande för nyttiga insekter, såsom pollinators. Tekniken kan utökas till icke-insekter ämnen också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insect lukt-medierade beteenden driver många olika processer, inklusive reproduktion, värd-plats urval och identifiering av lämpliga livsmedel resurser. Studiet av dessa processer kräver förmåga att identifiera de flyktiga avges från källan, liksom förmågan att identifiera de föreningar som förmedlar de beteenden. Komplicerande ärenden är att lukt består av tiotals till hundratals enskilda föreningar som tillsammans skapar en unik doft som uppfattas annorlunda än de enskilda beståndsdelarna 6,7,13…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NSF bidrag IOS 1121692 och av University of Washington Research Foundation.
Materials
| Name of item | Company | Catalog Number | Comments |
| Porapak Type Q 80-100 mesh | Waters | WAT027060 | |
| Reynolds Oven Bags | Reynolds | ||
| GC | Agilent | 7820A | |
| GC column | J&W Scientific, Folsom, CA, USA | DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm) | |
| Analytical helium carrier gas | Praxair | HE K | 1 cc/min |
| 16-channel silicon electrode | Neuronexus Technologies | a4x4-3mm50-177 | |
| Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter) | Sandvik Kanthal HP Reid | PX000004 | For making custom tetrodes and stereotrodes |
| Pre-amplifier | Tucker-Davis System | PZ-2 | |
| Amplifier | Tucker-Davis System | RZ-2 | |
| Data acquisition system – OpenEx suite | Tucker-Davis System | ||
| Online spike-sorting software – SpikePac | Tucker-Davis System | ||
| Offline spike-sorting software – Mclust Spike-sorting toolbox | David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota | Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html | MATLAB toolbox |
References
- Hildebrand, J. G., Shepherd, G. M. Mechanisms of olfactory: converging evidence for common principles across phyla. Annual Review of Neuroscience. 20, 595-631 (1997).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Bernays, E. A., Hildebrand, J. G. Antagonistic effects of floral scent in an insect-plant interaction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277, 2371-2379 (2010).
- Reisenman, C. E., Riffell, J. A., Hildebrand, J. G. . International Symposium on Olfaction and Taste. 1170, 462-467 (2009).
- Alarcón, R. Congruence between visitation and pollen-transport networks in a California plant-pollinator community. Oikos. 119, 35-44 (2010).
- Alarcón, R., Waser, N. M., Ollerton, J. Year-to-year variation in the topology of a plant-pollinator interaction network. Oikos. 117, 1796-1807 (2008).
- Riffell, J., et al. Behavioral consequences of innate preferences and olfactory learning in hawkmoth-flower interactions. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3404-3409 (2008).
- De Moraes, C. M., Lewis, W. J., Pare, P. W., Alborn, H. T., Tumlinson, J. H. Herbivore-infested plants selectively attract parasitoids. Nature. 393, 570 (1998).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. -. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464, 66-71 (2010).
- Turner, S. L., et al. Ultra-prolonged activation of CO2-sensing neurons disorients mosquitoes. Nature. 474, 87-91 (2011).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1725 (2010).
- Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. J. Vis. Exp. (49), e2489 (2011).
- Roelofs, W. L., Comeau, A., Hill, A., Milicevic, G. Sex attractant of the codling moth: characterization with electroantennogram technique. Science. 174, 297-299 (1971).
- Riffell, J. A., Lei, H., Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Characterization and coding of behaviorally significant odor mixtures. Current Biology. 19, 335-340 .
- Riffell, J. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Neural correlates of behavior in the moth Manduca sexta in response to complex odors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 106, 19219-19226 (2009).
- Raguso, R. A., Pellmyr, O. Dynamic headspace analysis of floral volatiles: a comparison of methods. Oikos. 81, 238-254 (1998).
- Rodriguez-Saona, C. R. Herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling. J Vis Exp. , e3440 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly. J Vis Exp. , e1098 (2009).
- Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. , e3282 (2011).
- Deisig, N., Giurfa, M., Lachnit, H., Sandoz, J. -. C. Neural representation of olfactory mixtures in the honeybee antennal lobe. European Journal of Neuroscience. 24, 1161-1174 (2006).
- Stökl, J., et al. A deceptive pollination system targeting drosophilids through olfactory mimicry of yeast. Current Biology. 20, 1846-1852 (2010).
- Schneider, D. Elektrophysiologische untersuchungen von chemo- und mechanorezeptoren der antenne des seidenspinners Bombyx mori L. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 40, 8-41 (1957).
- Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. The electroantennographic detector: a selective and senstitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Zeitschrift für Naturforschung. 30c, 722-725 (1975).
- Schneider, D., Boeckh, J. Rezeptorpotential und nervenimpulse einzelner olfaktorischer sensillen der insektenantenne. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 45, 405-412 (1962).
- Blight, M. M., Pickett, J. A., Wadhams, L. J., Woodcock, C. M. Antennal perception of oilseed rape Brassica napus (Brassicaceae) volatiles by the cabbage seed weevil Ceutorhynchus assimilis (Coleoptera, Curculionidae). Journal of Chemical Ecology. 21, 1649-1664 (1995).
- Lin, D. Y., Shea, S. D., Katz, L. C. Representation of natural stimuli in the rodent main olfactory bulb. Neuron. 50, 937-949 (2006).
- Lei, H., Reisenman, C. E., Wilson, C. H., Gabbur, P., Hildebrand, J. G. Spiking patterns and their functional implications in the antennal lobe of the tobacco hornworm Manduca sexta. PLoS ONE. 6, e23382 (2011).
- Syed, Z., Leal, W. S. Acute olfactory response of Culex mosquitoes to a human- and bird-derived attractant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 18803-18808 (2009).
