Identifisering av Olfactory Flyktige ved hjelp av gasskromatografi-Multi-unit Recordings (GCMR) i Insekt antennal Lobe

Summary

Olfactory pekepinner megle mange forskjellige virkemåter i insekter, og er ofte komplekse blandinger som består av flere titalls til hundrevis av flyktige forbindelser. Ved hjelp av gasskromatografi med flerkanals innspilling i insekt antennal lobe, beskriver vi en fremgangsmåte for identifisering av bioaktive forbindelser.

Abstract

Alle organismer lever i en verden full av sensoriske stimuli som bestemmer deres atferdsmessige og fysiologiske responsen til sitt miljø. Luktesans er spesielt viktig i insekter, som bruker sine olfactory systemer for å svare på og diskriminere blant, komplekse lukt stimuli. Disse lukt lokke fram atferd som formidler prosesser som reproduksjon og habitatvalg ^1-3. I tillegg, kjemiske sensing av insekter formidler atferd som er av stor betydning for landbruk og helse, herunder pollinering ^4-6, herbivory av matprodukter ^7, og overføring av sykdom ^8,9. Identifisering av olfactory signaler og deres rolle i insekt atferd er derfor viktig for å forstå både økologiske prosesser og menneskelige matressurser og trivsel.

Til dags dato har identifisering av flyktige som driver insekt atferd vært vanskelig og ofte langtekkelig. Dagens teknikker inkluderergasskromatografi-coupled electroantennogram opptak (GC-EAG) og gasskromatografi-kombinert enkelt sensillum opptak (GC-SSR) ^10-12. Disse teknikkene viste seg å være viktig i identifisering av bioaktive forbindelser. Vi har utviklet en metode som bruker gasskromatografi koplet til flerkanals elektrofysiologiske opptak (kalt 'GCMR') fra nerveceller i antennal lobe (AL; insekt primære olfactory sentrum) ^13,14. Denne state-of-the-art teknikken tillater oss å undersøke hvordan lukt informasjon er representert i insekt hjernen. Videre, fordi nevrale responser av lukter på dette nivået av olfactory prosessering er svært sensitive grunn av graden av konvergens av antenneposisjonen reseptor nevroner i AL nevroner vil AL innspillinger tillate påvisning av aktive bestanddeler av naturlige lukt effektivt og med høy følsomhet. Her beskriver vi GCMR og gi et eksempel på bruken.

Flere generelle tiltak er INVOLVED i deteksjon av bioaktive flyktige og insekt respons. Flyktige først må hentes fra kilder av interesse (i dette eksempelet bruker vi blomster fra slekten Mimulus (Phyrmaceae)) og karakterisert som nødvendig ved hjelp av standard GC-MS teknikker ^14-16. Insekter er forberedt for undersøkelse ved hjelp minimal disseksjon, hvoretter en innspilling elektrode settes inn i antennal lobe og flerkanals nevrale opptaket begynner. Post-prosessering av de nevrale data avslører deretter hvilke spesielle odorants forårsake betydelige nevrale responser av insekt nervesystemet.

Selv om eksemplet vi presenterer her er spesifikke for pollinering studier, kan GCMR utvides til et bredt spekter av studier organismer og flyktige kilder. For eksempel, kan denne metoden brukes i identifisering av odorants tiltrekke eller repelling vektor insekter og crop pester. Videre kan GCMR også brukes til å identifisere tiltrekningsmidler for fordelaktig insekter, for eksempel pollinators. Teknikken kan bli utvidet til ikke-insekt fag så vel.

Protocol

1. Flyktig Follection I dette eksempelet bruker vi flyktige prøver fra M. lewisii blomster – en alpin wildflower innfødt til California. Flyktige stoffene samles ved hjelp av dynamiske sorpsjon metoder ifølge Riffell m.fl.. 14. Kort, bruker denne metoden en lukket sløyfe fangst system hvor blomstene er omsluttet av en Teflon bag. Bruke et inert vakuumpumpen, er luften rundt blomstene sugd gjennom en "felle" består av en Pasteur-pipette fylt med Porapak Q matrise. Av…

Representative Results

I GCMR analysen ved hjelp av M. lewisii floral duft, injiserer vi 3 pl av pakke inn i den GC. Det totale antall flyktige eluerte gjennom GC er typisk 60-70 flyktige. Duften av M. lewisii er hovedsakelig sammensatt av monoterpenoids, inkludert β-myrcen (asyklisk) og α-pinen, med resten av duft sammensatt av seks-karbon flyktige, slik som 2-heksanol, og Sesquiterpenoids som utgjør <1% av headspace. GCMR utnytter av sensitiviteten antennal lobe nevroner…

Discussion

Insect olfactory-medierte atferd kjøre mange forskjellige prosesser, herunder reproduksjon, host-området utvalg, og identifisering av aktuelle matressurser. Studiet av disse prosessene krever evne til å identifisere de flyktige avgis fra kilden, samt evnen til å identifisere de forbindelser som formidling virkemåtene. Kompliserende forhold er at lukt består av titalls til hundrevis av individuelle forbindelser som til sammen skaper en unik duft som oppfattes annerledes enn de enkelte bestanddeler ^{6,7,13,19,20…}

Materials

Name of item	Company	Catalog Number	Comments
Porapak Type Q 80-100 mesh	Waters	WAT027060
Reynolds Oven Bags	Reynolds
GC	Agilent	7820A
GC column	J&W Scientific, Folsom, CA, USA	DB-5 (30 m, 0.25 mm, 0.25 μm)
Analytical helium carrier gas	Praxair	HE K	1 cc/min
16-channel silicon electrode	Neuronexus Technologies	a4x4-3mm50-177
Fine wire NiCr, 0.012 mm diameter)	Sandvik Kanthal HP Reid	PX000004	For making custom tetrodes and stereotrodes
Pre-amplifier	Tucker-Davis System	PZ-2
Amplifier	Tucker-Davis System	RZ-2
Data acquisition system – OpenEx suite	Tucker-Davis System
Online spike-sorting software – SpikePac	Tucker-Davis System
Offline spike-sorting software – Mclust Spike-sorting toolbox	David Redish, Department of Neuroscience, University of Minnesota	Free download at http://redishlab.neuroscience.umn.edu/MClust/MClust.html	MATLAB toolbox