基于miRNA的质粒在发展中的神经管和表型的评估DiI荧光注射开卷准备在卵的电
Summary
可以下调基因的表达在神经管的方法是，在特定的细胞类型，可跟踪的方式进行描述。我们演示了如何<em在OVO</em>电的小分子RNA的质粒，引起时空控制的RNA干扰可用于研究在发展中的神经管连合轴突导向。
Abstract
，连合DI1神经元已被广泛研究，阐明在开发过程中1,2轴突导向机制。这些神经元位于脊髓背侧，并发送它们的轴突沿着千篇一律的轨迹。最初连合轴突投射腹侧向，然后整个floorplate的。这些轴突穿越中线后，锋利的喙转，纵向对大脑的项目。受这些步骤中的每一步的协调活动的吸引力和排斥力的指导线索。这些线索的正确解释轴突的他们的划定途径上的指导是至关重要的。因此，一个特定的分子的生理贡献连合轴突引导理想地调查的上下文中的生活胚胎。因此，必须精确控制体内的基因敲除，以仔细分辨轴突导向活动的基因，可以播放多种在开发过程中的角色。
在这里，我们描述的方法敲除基因表达的鸡神经管在细胞类型特异性的，可追溯的方式。我们使用3窝藏细胞类型特异性的启动子/增强子驱动表达的荧光蛋白的标志，然后直接由miR30的RNAi誊4（位于内的3'-UTR的cDNA编码的荧光蛋白质）（新的质粒载体图1）。神经管电转化时，这些载体引起有效的基因表达下调，表达明亮的荧光标记蛋白，能直接跟踪的细胞经历击倒3。混合不同的RNAi载体电穿孔之前，允许在独立的区域的脊髓中的两个或多个基因的同时击倒。这使得复杂的细胞和分子间的相互作用，在开发过程中，要检查的方式，速度快，S实施，精确和便宜。用DiI开卷准备5连合轴突轨迹跟踪的结合，这种方法是一种有用的工具， 体内的细胞和分子机制的研究，连合轴突生长和指导。原则上，任何启动子/增强子可以被使用，可能使该技术更广泛地适用于在体内研究6在开发过程中的基因功能。
此视频演示了如何处理和窗口鸡蛋，成神经管和注射的DNA质粒，电穿孔程序。连合轴突导向探讨，从胚胎中取出脊髓为开卷编制，固定，注射用DiI，使轴突途径可以追溯到。脊髓之间安装的盖玻片和可视化，利用共聚焦显微镜。
Protocol
Discussion
这个简单的，基于矢量的人工miRNA的表达策略可用于敲除内源性基因表达的鸡神经管。这些功能的工具提供了多种基因沉默，时间控制和特异性的细胞类型，以方便阐明复杂的发育途径。特别是，我们已经证明了这些质粒中的实用程序在连合轴突引导，因为质粒可用于连合神经元的不同的基因敲除，或在它们的中间目标中，floorplate 3。
miRNA的表达质粒（因此，沉?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在实验室中，ES的工作是由瑞士国家科学基金会的支持。我们想感谢节拍昆茨拍摄的协助。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| 0.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B120F-4 |
| Glass needle puller | Narishige | PC-10 |
| Electroporator | BTX | ECM 830 |
| Sylgard silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 |
| Tungsten wire, 0.075 mm | World Precision Instruments | TGW0325 |
| Insect pins, 0.20 mm | Fine Science Tools | 26002-20 |
| Insect pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fast DiI | Molecular Probes | D-7756 |
| Fluorescent microscopes | Olympus | SZX12, BX51 |
References
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Development. 4, 21 (2009).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development. Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).
- Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. 발생학. 294, 554-563 (2006).
- Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo. Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29, 123-132 (2001).
- Kieleczawa, J. Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats. Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo. J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).
- Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices. Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).
- Murphy, M. C., Fox, E. A. Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract. Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Li, X., Lufkin, T. Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III. Genesis. 26, 121-122 (2000).
- Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).
- Cullen, B. R. Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments. Nature Methods. 3, 677-681 (2006).
