신경 튜브의 유전자 발현은 세포 유형의 특정, 추적 방식으로 downregulated 할 수있는이 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 방법을 보여줍니다 비켜에서 electroporation은 개발 신경 튜브에 commissural 축삭 안내를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에
이 논문에서
요약
초록
Commissural dI1 뉴런은 광범위하게 개발 1,2 동안 축삭 안내를 근간 메커니즘을 명료하게하다하는 연구되었습니다. 이 뉴런은 등쪽 척추에 위치하고 있으며, 틀에 박힌 궤도를 따라 자신의 axons을 보내 수 있습니다. Commissural axons는 처음으로 다음 floorplate에서 ventrally 프로젝트. 중간 선을 넘어 한 후에는 다음과 axons은 길이 방향으로 뇌에 대한 날카로운 뱃 부리 장식이있는 회전과 프로젝트를합니다. 다음 단계에 각각 매력적이고 혐오스러운지도 단서의 조율 된 활동에 의해 조절된다. 이러한 신호의 올바른 해석은 demarcated 경로를 따라 axons의지도에 매우 중요합니다. 따라서, commissural 축삭 안내에 특정 분자의 생리 기여 이상적인 생활 배아의 맥락에서 조사하고 있습니다. 따라서, 생체 내 유전자 최저는 정확하게 신중하게 여러 재생할 수 있습니다 유전자의 축삭 유도 활동을 구분하기 위해 통제되어야합니다개발하는 동안 역할.
여기, 우리는 셀 타입 별, 추적 방식으로 닭 신경 튜브의 분해 유전자 발현하는 방법을 설명합니다. 우리는 3 셀 타입 별 발기인 / 형광 단백질 마커의 표현을 유도 강화를 품고 miR30-RNAi의 성적표 4 (cDNA 인코딩 형광 단백질의 3'-UTR 내에있는 ()에 의해 직접 다음 소설 플라스미드 벡터를 사용하여 그림 1). 개발 신경 튜브에 electroporated 때,이 벡터는 유전자 발현의 효율적인 downregulation을 유도하고 최저 3 체험 세포의 추적 직접 사용 밝은 형광 마커 단백질을 표현한다. electroporation하기 전에 다른 RNAi 벡터를 혼합하면 척추의 독립적 인 지역에서 두 개 이상의 유전자의 동시 분해 할 수 있습니다. 이 빠른 방식, S에서 개발되는 동안 검사되는 복잡한 세포와 분자 상호 작용을 허용, imple 정확하고 저렴. 오픈 도서 준비 5 commissural 축삭의 탄도의 DiI 추적과 함께,이 방법은 commissural 축삭의 성장과지도의 세포와 분자 메커니즘의 생체 연구를위한 유용한 도구입니다. 원칙적으로 모든 발기인 / 인핸서는 잠재적으로 개발 6시 유전자 기능의 생체 연구에 대한 기술이 널리 적용하고, 사용할 수 있습니다.
이 동영상을 먼저 처리하는 방법을 보여줍니다 및 창 계란, 신경 튜브에 DNA의 plasmids의 주입과 electroporation 절차. commissural 축삭 안내를 조사하려면, 척추은 오픈 북 준비로 배아에서 제거 고정하고, 축삭 경로를 추적 할 수 있도록 DiI으로 주입된다. 척추 코드는 coverslips 사이에 장착 공 촛점 현미경을 사용하여 시각화합니다.
프로토콜
1. 셀 타입 별 유전자 입을에 대한 RNAi 플라스미드 DNA의 작성
Plasmids는 (그림 1)과 같은 이전에 상세 3,4에 설명 된 표준 분자 복제 기술을 사용하여 합성합니다.
벡터에 1.1 복제 : oligonucelotide 디자인
- 우리는 같은 보편적 oligonucleotides와 pRFPRNAiC 벡터 4 (아크 - 유전체학)와 함께 제공되는 제품 정보에 설명되어 복제 프로토콜을 사용합니다.
- 첫 번째 머리 핀의 자형 사이트에 복제를 들면 :
5 '프라이머 HP1 :
5'-GGCGGGGCTAGCTGGAGAAGATGCCTTCCGGAGAGGTGCTGCTGAGCG
3 '프라이머 HP1 :
5'-GGGTGGACGCGTAAGAGGGGAAGAAAGCTTCTAACCCCGCTATTCACCACCACTAGGCA - : 두 번째 머리 핀의 자형 사이트에 복제에 대한
5 '프라이머 HP2 :
5'-GGCGGGACGCGTGCTGTGAAGATCC....
- 첫 번째 머리 핀의 자형 사이트에 복제를 들면 :
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토론
이 간단한, 벡터 기반의 인공 miRNA 표현 전략은 닭 신경 튜브에 최저 내생 유전자 발현에 사용할 수 있습니다. 이 기능 도구는 복잡한 발달 경로의 해설을 촉진하기 위해 여러 유전자 입을, 시간적 제어 및 세포 유형 특이성을 제공합니다. plasmids은 commissural 뉴런에 또는 중간 타겟, floorplate 3 최저 별개의 유전자하는 데 사용할 수 있기 때문에 특히, 우리는 commissural 축삭지도에서 이러한 plasmids의 유틸리티를 증명하고있다.
miRNA - 표현의 plasmids (및 따라서, 침묵 세포)에서 생성 된 형광 단백질 표현의 강도와 위치는 다음 매개 변수에 따라 달라집니다 :
- 증폭기는 사용 :
- β-고를업자는 ubiquitously 활성화
- Math1 증강은 dI1 뉴런 12 활성
- 을 Hoxa1.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
ES의 연구실에서 작업은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원됩니다. 우리는 촬영과 도움 박사 비트 Kunz 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 0.5 mm 유리 모세관 | 세계 정밀 계측기 | 1B120F-4 | |
| 유리 바늘 풀러 | Narishige | PC-10 | |
| Electroporator | BTX | ECM 830 | |
| Sylgard 실리콘 엘라스토머 | 세계 정밀 계측기 | SYLG184 | |
| 텅스텐 와이어, 0.075 mm | 세계 정밀 계측기 | TGW0325 | |
| 곤충 핀, 0.20 mm | 정밀 과학 도구 | 26002-20 | |
| 곤충 핀, 0.10 mm | 정밀 과학 도구 | 26002-10 | |
| 봄 가위 | 로 정밀 과학OLS | 15003-08 | |
| 뒤몽 # 5 포셉 | 정밀 과학 도구 | 11252-20 | |
| 뒤몽 # 55 포셉 | 정밀 과학 도구 | 11255-20 | |
| 빠른 DiI | 분자 프로브 | D-7756 | |
| 형광 현미경 | 하늘 | SZX12, BX51 |
참고문헌
- Chédotal, A. Further tales of the midline. Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).
- Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneuron....
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