Her beskriver vi hvordan du kan identifisere stadium av murine reproduktive (proestrus, estrus, metestrus eller diestrus) med enkle, ikke-invasiv innsamling og cytologisk vurdering av vaginal smear prøver. Vi videre beskrive hvordan vaginal cytologi reflekterer sirkulerende hormonelle nivåer underliggende overgang gjennom murine reproduktive syklus.
En rask metode for å bedømme reproduktiv status hos gnagere er nyttig ikke bare i studiet av reproduktive dysfunksjon, men er også nødvendig for produksjon av nye musemodeller av sykdom og undersøkelser i hormonell regulering av vev degenerasjon (eller regenerering) etter patologisk utfordring. Murine reproduktive (eller estrous) syklus er delt inn i 4 stadier: proestrus, estrus, metestrus og diestrus. Definerte svingninger i sirkulerende nivåer av ovarian steroider 17-β-østradiol og progesteron, de gonadotropiner luteiniserende og follikkelstimulerende hormoner, og luteotropic hormonet prolaktin signal overgang gjennom disse reproduktive stadier. Endringer i celle typologi innenfor murine vaginal kanalen gjenspeiler disse underliggende endokrine hendelser. Daglig vurdering av den relative andel av kjerneholdige epitelceller, cornified squamous epitelceller, og leukocytter stede i vaginale utstryk kan brukes til å identifisere murine estrousstadier. Graden av invasivitet imidlertid ansatt i å samle inn disse prøvene kan endre reproduktiv status og lokke fram en betennelsesreaksjon som kan forvirre cytologisk vurdering av utstryk. Her beskriver vi en enkel, ikke-invasiv protokoll som kan brukes til å bestemme fasen av brunst av en kvinnelig mus uten å endre sin reproduktive syklus. Vi detalj hvordan å skille mellom de fire stadier av brunst ved innsamling og analyse av dominerende celle typologi i vaginal smears og vi viser hvordan disse endringene kan tolkes i forhold til endokrine status.
Disse endringene i celle typologi er tegn på underliggende endokrine hendelser. Den proestrus fase av brunst tilsvarer den menneskelige follikkelfase av menstruasjonssyklusen 5 og er definert av en pre-ovulasjon økning i sirkulerende 17-β-østradiolnivåer 6, så vel som en liten bølge i prolaktin 7 (figur 2, proestrus, venstre panel). Økningen i 17-β-østradiol stimulerer indirekte gonadotropinfrigjørende hormon nevroner i hypothalamus og septum som, i sin tur, aktiverer responsive celler i fremre hypofyse å frigi luteiniserende hormon og follikkelstimulerende hormon til sirkulasjonen 8,9 (Figur 2 , proestrus, venstre panel). I vaginal smears tatt fra dyr i proestrus, cellene er nesten utelukkende ovale kjerneholdige epitelceller (figur 1D, Figur 2, proestrus, høyre panel). Toppen i follikkelstimulerende Hormen nivåer signaler eggløsning og oppføring i estrus 10,11. Under estrus, 17-β-østradiol nivåer nedgang og prolaktin nivå topp 6,7 (Figur 2, estrus, venstre panel). Vaginal smears er preget av nesten eksklusive påvisning av uregelmessig-formet cornified squamous epitelceller ofte i klumper (figur 1E, figur 2, estrus, høyre panel). Inntreden i metestrus sammenfaller med en kontinuerlig økning i progesteron hormonnivået 6 og tilsvarer begynnelsen av menneskets lutealfasen 12 (figur 2, Metestrus, venstre panel). Som progesteron nivået begynner å stige, og det er en liten økning i 17-β-østradiolnivåer i respons til corpus luteum aktivering 6,13,14 (Figur 2, Metestrus, venstre panel). Celletyper stede i vaginal smears i denne fasen er fragmenterte, cornified epitelceller og mindre mørkere farget leukocytter (Figure 1F, figur 2, Metestrus, høyre panel). Endelig oppstår inngåelse diestrus hos mus og sirkulerende progesteronnivåer 6 topp, tilsvarende den menneskelige sent lutealfasen 12. Regresjon av corpus luteum fører til en senere kraftig nedgang i progesteron nivå 15,16 (figur 2, Diestrus, venstre panel). Leukocytter dominerer i smears under diestrus. Frekvensen av cornified epitelceller reduseres og kjerneholdige epitelceller begynner å påvises like før overgangen til proestrus (figur 1G, figur 2, Diestrus, høyre panel).
Oppsummert kan denne enkle, rutinemessige protokollen brukes til å beregne daglige hormonelle svingninger og etablere estrous stadium i eksperimentelle mus uten å endre reproduktiv status hvis følgende forholdsregler er tatt. Prøvetaking skal utføres ikke mer enn en gang daglig ved hjelp av ikke-invasive protokoll described her i forhold til gjentatte penetrasjon av vaginal kanalen, aspirasjon, og agitasjon. Dette kan forårsake vaginal irritasjon resulterer i en inflammatorisk respons 17 resulterer i leukocytter og andre celletyper å være tilstede i utstryk som kan forvirre cytologisk vurdering. Dessuten, selv i koloni-huset kvinner, er det normalt å se utvidede diestrus og estrus stadier i forskjellige mus også induksjon av anestrous 18 og denne identifikasjonen er nyttig i tolkningen av hormonelle effekt i reproduktiv, kjønn og sykdom studier. Variasjon i sykluslengde er også introdusert med alder og etter boliger forskjeller innenfor kolonier (individ eller gruppe-bolig) av kvinner 7,19-21. Kvinner som lever i kvinnedominerte bare kolonier kan opphøre sykling og skriv en tilstand av langvarig diestrus 18,22,23 selv sykling kan gjenopprettes ved eksponering for bur forbehandlet med mannlig urin for å lokke fram sykling 24,25. Derfor, for å etablere individual sykluslengder for en gitt mus, anbefales det at de ikke-invasive nærmere beskrevet her utføres daglig, med omsorg, inntil to komplette sykluser er observert.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Marc Leonard fra Carleton Immersive Media Studio for ekspert teknisk bistand i videoproduksjon og redigering og Dr. Martin Bertrand fra Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Laboratorium for visuell modell assistanse. Forfatterne takknemlig erkjenne ekspertråd av Dr. Marilyn keaney og alle hennes dedikerte ansatte ved Universitetet i Ottawa Animal Care og veterinærtjenester. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) til SALB, den CIHR Institute of Aging og strategisk initiativ i Helse / CIHR Training Program i Nevrodegenerative Lipidomics (TGF 96121) til SALB og SF, Canadian Foundation for innovasjon til SF, Ontario Innovation Trust til SF, og Autodesk Forskning til SF. ACM mottar en CIHR Banting og Best doktor prisen. NV får en post-profesjonell fellesskap fra Institute of Aging og CIHR Training Program i nevrodegenerative Lipidomics.
Name | Company | Catalogue # |
Sterile 200 μl pipette tips | Diamed | E340901 |
Latex bulb (1 ml) | Fisher | 03-488-21 |
Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 |
Crystal Violet stain (25 g) | Fisher | C581-25 |
Light-duty Tissue Wipers | VWR | 82003-820 |
Glycerol | Fisher | BP229-1 |
Microscope Cover Glass (22×30) | Fisher | 12-544A |