RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞
Summary
このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。
Abstract
mRNAレベルの測定を介して細胞内での遺伝子発現の特性は、細胞の転写機構を外部信号（ 例えば、薬物治療）、またはどのように細胞が健康な状態と病気の状態の間で異なることによりどのような影響を受けるかを決定するのに有用なツールです。次世代DNAシーケンシング技術の出現と連続洗練された、RNAシーケンシング（RNA-seq）は、転写物の全ての種をカタログ化するすべての発現している遺伝子の転写構造を決定するために、定量化するトランスクリプトーム解析のますます普及している方法となっている与えられた細胞、組織または生物1,2における転写産物の全体集合の変化の発現レベル。 RNA-seqは徐々にそれが完全なトランスクリプトームのプロファイリングの利点を持っているので、トランスクリプトーム解析のための好ましい方法として、DNAマイクロアレイを交換するデジタルdatum型（任意の転写物のコピー数）を提供すると、任意の既知のゲノムシーケンシャルに頼っていませんCE 3。
ここでは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqを適用するための完全かつ詳細なプロトコルを提示。このプロトコルは、と題する我々の最近発表された研究に基づいている我々は正常ヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム解析を行っている4 "RNA-seqはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞における遺伝子およびそのアイソフォームの新規トランスクリプトームを明らかにする" RNA-seqを使用してトロンビンで処理した。これは、炎症状態、癌、糖尿病、冠状動脈性心臓病の病因におけるトロンビン媒介内皮機能不全の分子機構についての洞察を得るためにさらなる実験のための前例のない資源をもたらし、これらの疾患に対する治療ターゲットの潜在的な新規のリードを提供しています。
このプロトコルの記述テキスト4つの部分に分かれています。最初の部分は、トロンビンおよびRNAの単離、品質分析と定量化したヒト肺微小血管内皮細胞の治療について説明しています。第二部では、ライブラリーの構築およびシーケンシングを説明しています。第三部は、データ分析を説明しています。 4番目の部分は、RT-PCR検証アッセイを記載する。いくつかの重要な手順の代表的な結果が表示されます。重要なステップでの成功を後押しするための有用なヒントや注意事項は、ディスカッション·セクションで提供されています。このプロトコルはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞を使用していますが、それは哺乳類と非哺乳類細胞の両方で、さまざまな刺激または阻害剤で処理した組織内のプロファイル·トランスクリプトームに一般化することができる、または健康状態の間の細胞または組織にトランスクリプトームを比較する疾病状態。
Protocol
Representative Results
Discussion
主な手順
RNAの取り扱い：RNaseがあっても、最も高品質のRNAを低下させます従ってケアはRNAを10の分離、貯蔵及び使用時に注意が必要です。手袋は常に人間の手で発見のRNaseの混入を防ぐために着用されています。手袋は、特に皮膚、ドアノブや他の共通の表面に触れた後、頻繁に変更する必要があります。ピペットのセットは、単に仕事をRNAに専念すべ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、我々のデータ解析のためのそれらのコンピューティング·クラスタの使用のために子供のマーシー病院や診療所で博士スティーブンKingsmoreと小児ゲノム医学センターに感謝したいと思い、イルミナのフィールドサービスチーム（エリザベス·ボワイエ、スコット·クック、マーク·クック）と技術彼らの迅速な対応と次世代DNAシーケンシング楽器、HiScanSQ、およびデータ品質分析の実行に関する有用な提案のためのコンサルタントチーム。この作品は、子供のマーシー病院や診療所の健康グラントHL080042（SQY）とスタートアップ資金や寄付金の国立研究所、カンザスシティ、ミズーリ大学（SQYへ）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
References
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