<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> ATPase Vesikkel Forberedelse og teknikk for utøvende Patch Clamp Innspillinger av Submitochondrial vesikkelmikrosomer Membraner
Summary
En metode for å isolere submitochondrial blemmer beriket i F1FO ATP syntase komplekser fra rotte hjernen er beskrevet. Disse vesikler tillate undersøkelse av aktiviteten av ATPase F1FO kompleks og dens modulasjon ved fremgangsmåten ifølge patch clamp opptak.
Abstract
Mitokondriene er involvert i mange viktige cellulære funksjoner, inkludert metabolisme, overlevelse ett, utvikling og, kalsium signalisering to. To av de viktigste funksjonene mitokondrielle er relatert til effektiv produksjon av ATP, energiverdi av cellen, ved oksidativ fosforylering, og formidling av signaler for programmert celledød 3..
Enzymet primært ansvarlig for produksjon av ATP er den F1FO-ATP syntase, også kalt ATP syntase 4-5. I de senere årene har rollen som mitokondriene i apoptotiske og nekrotiske celledød fått stor oppmerksomhet. I celledød ved apoptose, BCL-2 familien proteiner som Bax inn mitokondrie ytre membran, oligomerize og permeabilize ytre membran, slippe pro-apoptotiske faktorer inn i cytosol seks. I klassisk nekrotisk celledød, slik som den som produseres av iskemi eller eksitotoksisitet i neuroner, en støre, dårlig regulert økning av matrise kalsium bidrar til åpningen av en indre membran pore, mitokondrie permeabilitet overgang pore eller MPTP. Dette depolarizes den indre membran og fører osmotiske skift, bidrar til ytre membran ruptur, frigjøring av pro-apoptotiske faktorer, og metabolsk dysfunksjon. Mange proteiner inkludert BCL-XL 7 samhandle med F1FO ATP syntase, modulerende sin funksjon. BCL-XL samhandler direkte med beta subenhet av F1FO ATP syntase, og dette samspillet reduserer en lekkasje ledningsevne i F1FOATPasecomplex, øke netto transport av H + av F1FO under F1FO ATPase aktivitet åtte og dermed øke mitokondrie effektivitet. Å studere aktiviteten og modulering av ATP syntase, isolert vi fra gnager hjernen submitochondrial vesikler (SMVs) inneholder F1FO ATPase. De SMVs beholde den strukturelle og funksjonelle integritet av F1FO ATPase som vist i Alavian et al. Her beskriver vi en fremgangsmåteat vi har brukt med hell for isolering av SMVs fra rottehjerne og vi avgrense patch clamp teknikk for å analysere aktiviteten på kanalen (ion lekkasje konduktans) av SMVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåtene beskrevet heri, muliggjøre isolering av ren mitokondrier ved slutten av trinn 1 og submitochondrial vesikler (SMVs) etter trinn 2 fra hel hjerne uten forskjell av celle phenotypes.SMVspurified ved denne fremgangsmåte er i det vesentlige fri for forurensning av andre subcellulære organeller som vist i Figur 1 og vår tidligere arbeid (Alavian KN et al. 8) og beholder sin strukturelle og funksjonelle integritet før frysing. Etter frysing og tining, isolerte mitokon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
