<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> أتباز إعداد الحويصلة وتقنية لإجراء التسجيلات المشبك التصحيح من أغشية الحويصلة Submitochondrial
Summary
ووصف طريقة لعزل الحويصلات submitochondrial المخصب في F1FO ATP مجمعات سينسيز من دماغ الفئران. هذه الحويصلات تسمح دراسة النشاط من مجمع أتباز F1FO والتشكيل وذلك باستخدام أسلوب التصحيح تسجيل المشبك.
Abstract
وتشارك الميتوكوندريا في العديد من الوظائف الخلوية الهامة بما في ذلك التمثيل الغذائي، والبقاء على قيد الحياة 1، والتنمية، والكالسيوم مما يشير 2. ترتبط اثنين من وظائف الميتوكوندريا الأكثر أهمية بالنسبة للكفاءة الإنتاج من ATP، والعملة الطاقة للخلية، من خلال الفسفرة التأكسدية، والوساطة من إشارات لموت الخلية المبرمج 3.
الإنزيم المسؤول في المقام الأول لإنتاج ATP هو سينسيز ATP-F1FO، وتسمى أيضا ATP سينسيز 4-5. في السنوات الأخيرة، تلقت دور الميتوكوندريا في موت الخلايا أفكارك ونخرية اهتماما كبيرا. في موت الخلايا أفكارك، BCL-2 البروتينات الأسرة مثل باكس دخول الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، oligomerize وpermeabilize الغشاء الخارجي، والإفراج عن العوامل الموالية لأفكارك في العصارة الخلوية 6. في موت الخلايا نخرية الكلاسيكية، مثل تلك التي ينتجها نقص التروية أو التحفيز الزائدة في الخلايا العصبية، تأه، وزيادة سيئة التنظيم في مصفوفة الكالسيوم يساهم في افتتاح مسام الغشاء الداخلي، والميتوكوندريا نفاذية المسام الانتقال أو MPTP. هذا depolarizes الغشاء الداخلي ويسبب تحولات ناضح، والمساهمة في تمزق غشاء الخارجي، وإطلاق سراح من العوامل الموالية لأفكارك، وضعف التمثيل الغذائي. العديد من البروتينات بما في ذلك بي سي إل XL 7 التفاعل مع F1FO ATP سينسيز، تحوير وظيفتها. BCL-XL يتفاعل مباشرة مع الوحيدات بيتا من F1FO ATP سينسيز، وهذا التفاعل يقلل من تصرف تسرب داخل F1FOATPasecomplex، وزيادة صافي النقل من H + من قبل F1FO خلال F1FO ATPase النشاط 8 وبالتالي زيادة كفاءة الميتوكوندريا. لدراسة النشاط والتشكيل من سينسيز ATP، ونحن عزل من القوارض الدماغ الحويصلات submitochondrial (SMVs) التي تحتوي على F1FO أتباز. وSMVs الإبقاء على السلامة الهيكلية والوظيفية للF1FO أتباز كما هو مبين في علويان وآخرون. هنا، نحن تصف طريقةالتي استخدمناها بنجاح لعزل SMVs من دماغ الفئران، ونحن ترسيم تقنية المشبك التصحيح لتحليل نشاط قناة (أيون تصرف تسرب) من SMVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت وسائل تمكين هنا عزلة الميتوكوندريا نقية في نهاية الخطوة 1 والحويصلات submitochondrial (SMVs) بعد الخطوة 2 من الدماغ كله دون تمييز من خلية phenotypes.SMVspurified بواسطة هذه الطريقة هي مجانية أساسا من التلوث بواسطة العضيات التحت خلوية أخرى كما هو مبين في الشكل (1) والعمل الساب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
