<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> ATPase Vehikelpræparationen og Teknik for Performing patchclamp Optagelser af Submitochondrial vesikelmembraner
Summary
En fremgangsmåde til at isolere submitochondrial vesikler beriget i F1FO ATP synthase komplekser fra rottehjerne er beskrevet. Disse vesikler tillader undersøgelse af aktiviteten af F1FO ATPase kompleks og dets modulation ved hjælp af teknikken af patch clamp optagelse.
Abstract
Mitokondrier er involveret i mange vigtige cellulære funktioner, herunder metabolisme, overlevelse 1, udvikling og, calcium signalering 2.. To af de vigtigste mitokondrie funktioner er relateret til den effektive produktion af ATP, energi valuta af cellen, ved oxidativ phosphorylering, og formidling af signaler for programmeret celledød 3..
Enzymet primært ansvarlige for produktionen af ATP er den F1FO-ATP syntase, også kaldet ATP syntase 4-5. I de senere år har den rolle mitokondrier i apoptotisk og nekrotisk celledød genstand for betydelig opmærksomhed. I apoptotisk celledød, indtaste BCL-2 familie proteiner, såsom Bax den mitokondriske ydre membran, oligomerisering og permeabilisere ydre membran, frigiver pro-apoptotiske faktorer i cytosolen 6.. I klassisk nekrotisk celledød, som sådan, der produceres af iskæmi eller excitotoxicity i neuroner, en large, dårligt reguleret stigning i matrix calcium bidrager til åbningen af en indre membran pore, mitokondrie permeabilitetsovergang pore eller MPTP. Dette depolariserer den indre membran og forårsager osmotiske skift, der bidrager til ydre membran brud, frigivelse af pro-apoptotiske faktorer, og metabolisk dysfunktion. Mange proteiner, herunder Bcl-xL 7 interagerer med F1FO ATP syntase, modulerende funktion. Bcl-xL interagerer direkte med betaunderenhed af F1FO ATP syntase, og dette samspil nedsætter en lækage ledningsevne i F1FOATPasecomplex, øge netto transport af H + ved F1FO under F1FO ATPaseaktivitet 8 og dermed øger mitokondrie effektivitet. At studere aktivitet og modulation af ATP syntase, vi isoleret fra gnaverhjerne submitochondrial vesikler (SMVs) indeholdende F1FO ATPase. De SMVs bevarer den strukturelle og funktionelle integritet F1FO ATPase som vist i Alavian et al. Her beskriver vi en metodeat vi har anvendt med succes til isolering af SMVs fra rottehjerne og vi afgrænse patch-clamp-teknik til at analysere kanal aktivitet (ion lækage konduktans) af SMVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De heri beskrevne fremgangsmåder muliggøre isoleringen af ren mitokondrier ved afslutningen af trin 1 og submitochondrial vesikler (SMVs) efter trin 2 fra hele hjernen uden skelnen mellem celle phenotypes.SMVspurified ved denne fremgangsmåde er i det væsentlige fri for kontaminering med andre subcellulære organeller, som vist i Figur 1 og vores tidligere arbejde (Alavian KN et al. 8) og bevarer deres strukturelle og funktionelle integritet inden frysning. Efter nedfr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
- Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).
- Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
- Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
- Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
- Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
- Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
- Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
- Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).
