Matrix-assisterad Autologous kondrocyttransplantation för ombyggnad och reparation av chondral Defekter i en kanin modell
Summary
En experimentell teknik för behandling av chondral defekter i kaninens knäleden beskrivs. Implantation av autologa kondrocyter ympade på en matris är en väl accepterad metod för ombyggnad och reparation av skador ledbrosk ge tillfredsställande resultat på lång sikt. Matrix-assisterad autolog kondrocyttransplantation (MACT) erbjuder ett standardiserat och kliniskt etablerad implantation metod.
Abstract
Ledbrosk defekter anses ett stort hälsoproblem eftersom ledbrosk har en begränsad kapacitet för självregenerering 1. Obehandlade broskskador leda till pågående smärta, negativt påverka livskvaliteten och mottaglig för artros. Under de senaste årtiondena har flera kirurgiska tekniker utvecklats för att behandla sådana lesioner. Men fram tills nu var det inte möjligt att uppnå en fullständig reparation i termer av att täcka defekten med hyaline ledbrosk eller tillhandahålla tillfredsställande långsiktig återhämtning 2-4. Därför artikulära broskskador förblir ett viktigt mål för regenerativa tekniker såsom Tissue Engineering. I motsats till andra kirurgiska tekniker, som ofta leder till bildningen av fibrös eller fibrocartilaginous vävnad syftar Tissue Engineering vid fullt ut återupprätta den komplexa strukturen och egenskaperna av den ursprungliga ledbrosk genom att använda kondrogena potentialen hos transplanterade celler. Recent utvecklingen öppnat lovande möjligheter för regenerativ brosk terapier.
Den första cellen synsättet för behandling av full tjocklek brosk eller osteokondrala lesioner utfördes 1994 av Lars Peterson och Mats Brittberg som bana klinisk autolog chondrocyte implantation (ACI) 5. Idag är tekniken kliniskt väl etablerad för behandling av stora hyalinbrosk defekter i knäet, upprätthålla goda kliniska resultat och med 10 till 20 år efter implantation 6. Under senare år genomgick implantation av autologa kondrocyter en snabb progression. Användningen av en konstgjord tredimensionell kollagen-matris på vilken celler senare omplanteras blev mer och mer populär 7-9.
MACT består av två kirurgiska förfaranden: Först, för att samla in kondrocyter, behöver en brosk biopsi som skall utföras från en icke viktbärande brosk område i than knäleden. Sedan är kondrocyter extraheras, renas och utvidgas till ett tillräckligt antal celler in vitro. Kondrocyter därefter ympas på en tre-dimensionell matris och kan därefter åter implanteras. När man förbereder en vävnadstekniska implantat, proliferationshastighet och differentiering kapacitet är avgörande för en framgångsrik vävnadsregenerering 10. Användningen av en tredimensionell matris som en cell bärare tros stödja dessa cellulära egenskaper 11.
Följande protokoll kommer att sammanfatta och demonstrera en teknik för isolering av kondrocyter från brosk biopsier, deras proliferation in vitro och deras seedning på en 3D-matris (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Schweiz). Slutligen kommer implantation av de cell-matrix-konstruktioner i artificiellt skapade chondral defekter av en kanin knäled att beskrivas. Denna teknik kan användas som en experimentell inställningför ytterligare experiment av brosk reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterade protokollet ger en etablerad 9,12,13 och enkelt reproducerbar teknik för att isolera autologa kondrocyter för efterföljande spridning och re-implantation i artificiellt skapade broskdefekter i kanin knä. Användningen av autologa kondrocyter för ombyggnad och reparation av skador ledbrosk är redan i kliniskt bruk som ger tillfredsställande resultat på lång sikt 6.
Stora problem som till exempel periostal hypertrofi och förkalkning, graft delam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har finansierats av det tyska Research Association (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
