암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
암 관련 섬유 아세포은 (CAFs) 특히 유방 암에, 많은 암의 종양 기질 내에서 가장 눈에 띄는 세포 유형으로, 그들의 눈에 잘 띄는 존재는 종종 가난한 예후 (豫后)의 1,2와 연결되어 있습니다. CAFs는 stromal 섬유 아세포의 활성화 subpopulation 있으며, 그 중 많은 myofibroblast 표시 α-SMA 3 표현한다. CAFs 지역 조직 섬유 아세포에서뿐만 아니라 골수 유래 세포 개발 종양으로 모집하고 종양 microenvironment (4)의 영향 아래 CAF의 표현형을 채택에서 유래. CAFs는 종양 세포 증식, 혈관 신생, 그리고 침략 5-8을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진하기 게재되었습니다. 우리는 CAFs는 초기 사전 neoplastic 단계 9시 시작, 종양 - 홍보 염증을 중재하여 종양 성장을 향상 것을 보여 주었다. 키 역할 CAFs의 증가에도 불구하고 증거가 종양 성장을 촉진에서 재생공부 CAFs은 종양 microenvironment 10 공동 기존의 여러 하위 유형이있는 CAF 특정 마커 및 이들 세포의 광대 한 이질성의 부족으로 인해 지속적 도전했다. 또한, 체외에서 섬유 아세포를 공부하는 것은 자신의 유전자 발현 프로파일은 종종 조직 배양 11,12에서 변경 있다는 사실에 의해 방해된다. 이 문제를 해결하기 위해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포의 편견 유전자 발현 프로파일을 허용하기 위해 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 13,14의 이전 프로토콜을 기반으로하는 방법을 개발했습니다. 우리 접근 방식은 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포를 분리 할 수있는 표면 마커로 PDGFRα을 사용에 의존하고 있습니다. PDGFRα이 넘치게 일반적인 섬유 아세포와 CAFs 9,15 모두에 의해 표시됩니다. 이 방법은 등의 일반적인 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구,의 고립하지만이 α-SMA으로 제한 할 수 있습니다 + myofibroblasts을 활성화. 절연 섬유 아세포는 할 수 있습니다특성화 및 tumorigenesis 동안 CAFs에서 발생하는 유전자 발현의 진화 비교에 사용됩니다. 사실, 우리와 다른 사람들은 16 정렬 세포에 의해 고립 된 섬유 아세포의 표현 프로파일을 발표했다. 이 프로토콜이 성공적으로 피부, 유방, 췌장과 폐 조직에서 섬유 아세포의 매우 풍부한 인구를 분리 및 프로필하기 위해 수행되었다. 또한, 우리의 방법은 작동 실험을 수행하는 문화 CAFs하려고 할 때 종종 큰 장애물입니다 종양 세포에 의한 오염을 방지하기 위해, 정렬 세포의 배양 할 수 있습니다.
프로토콜
1. 마우스에서 유방이나 피부 조직을 박리
- 마우스에서 원하는 조직을 해부하기 전에 다음과 같은 용품 및 시약을 준비 :
공급 :
- 수술 도구 (세제로 세척 한 후 70 % 에탄올에 담근).
- 스티로폼 표면은 절개 중에에 마우스를 말이다.
- 핀이나 바늘은 절개 중에 쥐를 개최합니다.
- 자기 저어 바 (autoclaved)를 포함하는 소화 뚜껑 유리 항아리.
- 37 번 물을 욕조 ° C, 저어 판에 쉬고있는 동안, 잠수함 자기 교반기와 잠수함 소화 병을 할 수있을만큼 물을 포함.
시약 :
- FACS 버퍼 I : (4 ° C) : Dulbecco의 인산이 (칼슘 마그네슘 무료) 식염 CMF 버퍼 + 0.5 % BSA
- Collagenase 솔루션 (바로 사용하기 전에 한) :
0.05 g Collagenase II
0.05 g Collagenase IV
0.01 g의 Deoxyribonuclease
20ML FACS 버퍼 I.는 사용까지 얼음에 collagenase 솔루션을하세요. - PharmL....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
조직 섬유 아세포의 높은 풍부한 인구의 고립 된 섬유 아세포 결과의 표시로 PDGFRα을 사용합니다. 정렬 후 순도의 수준은 후 정렬 분석 (그림 2A)에 의해 정량 99 %이다. 셀 - 특정 제어 유전자의 상대적 표현 (그림 2B)에 의해 비 섬유 아세포 세포를 오염 수의 비율을 추정하는 것은 일반적으로 0.1-0.6 %의 오염을 보여줍니다. 순도 수준은 절연 섬유 아세포 9 고품질의 transcriptome 프로파일 할 수 있습니다.
유방 땀샘에서 조직의 섬유 아세포의 비율은 정상 유방 조직에서 5-20%, 그리고 MMTV-PyMT 종양의 1-5% 사이에 다릅니다. 종양 조직에서 섬유 아세포의 상대적 비율은 상피 구획의 대규모 확장으로 인해 섬유 아세포의 총 수 증가에도 불구하고, 사전 neoplastic 조직에 비해 낮습니다. 종양 조직에서 분리 섬유 아세포의 감소 %도의 결과입니다기술적 어.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
조직 문화에 실험을 유익하게 생체에서 확인 할 수 있습니다 기능 원리를 제안 할 수 있지만, 그것은 문화 11,12의 세포의 유전자 발현에 큰 변화가 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 섬유 아세포의 유전자 발현 프로파일 링 할 때 조직 문화 단계를 피하기 위해, 우리는 할 수 있습니다 신선한 마우스 또는 인체 조직의 정상뿐만 아니라 암 관련 섬유 아세포의 분리.에게 프로토콜을 개발 이 프로토콜이 성공적으로 마우스와 인간 9 일부터 피부, 췌장 및 유방 조직에 적용되었습니다. FACS 정렬에 의한 섬유 아세포의 절연은 표면 마커 라벨의 섬유 아세포가 필요합니다. 우리는 PDGFRα는 섬유 아세포 9 매우 풍부한 인구의 절연을 수있는 강력한 표면 마커입니다 설립했다. 또한, PDGFRα 따라서 편견 절연 및 프로파일 조직 섬유 아세포의보다 focusi을 허용, 일반 조직 섬유 아세포 모두와 CAFs에 표시됩니다특정 subpopulation에 NG.
.......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 FACS 정렬과의 도움을 박사 Yitzchak Oschry 박사 Orit Sagi - Asif 감사드립니다. 이 연구는 보조금 협정 N 아래에있는 유럽 연합 (EU) 세븐 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에서 NE에 대한 교부금에 의해 지원되었다 ° [276890] 이스라엘 암 협회 (# 20110078)에서와 이스라엘 암 연구 기금 (연구에서 경력 개발 상).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 회사 소개 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항) | |||
| DMEM | Gibco | 41,965 | |
| PBS | 생물 산업 | 02-023 - 1A | |
| Collagenase II | 워싱턴 | LS4176 | |
| Collagenase IV | 워싱턴 | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | 워싱턴 | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| 셀 스트레이너 70 μm | SPL | 93,070 | |
| 정화 안티 - 마우스 CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 비아 프로브 (7AAD) | 전자 Bioscience | 00-6993-50 | |
| 안티 - 마우스 CD140a-PE (PDGFRa) | 전자 Bioscience | 12-1401-81 | |
| 안티 - 마우스 F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w / O 페놀 레드 | Gibco | 31,053 | |
| 콜라겐 유형 I | BD Biosciences | 354236 |
참고문헌
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
