Kreft assosiert Fibroblaster (kafeer) legge til rette startfasen, vekst og fremgang gjennom signaliserer som fremmer spredning, angiogenese, og betennelser. Her beskriver vi en metode for å isolere rene bestander av vanlige fibroblaster og kafeer fra frisk mus og menneskelig vev ved celle sortering, ved hjelp PDGFRα som en overflate markør.
Kreft-tilknyttede fibroblaster (kafeer) er de mest fremtredende celletype i tumor stroma av mange kreftformer, særlig brystkreft, og deres fremtredende tilstedeværelse er ofte forbundet med dårlig prognose 1,2. Er cafs en aktivert subpopulasjon stromale fibroblaster, hvorav mange uttrykker myofibroblast markør α-SMA 3. Kafeer stammer fra lokale vev fibroblaster samt fra benmargen-avledet celler rekruttert til å utvikle svulst og vedta en CAF fenotype under påvirkning av svulsten mikromiljøet 4. Kafeer ble vist til rette startfasen, vekst og fremgang gjennom signaliserer som fremmer tumor celleproliferasjon, angiogenese, og invasjonen 5-8. Vi viste at kafeer forbedre tumorvekst ved å formidle tumor-fremme betennelse, starter tidligst pre-neoplastiske stadier 9. Til tross for økende bevis av de viktigste rollen kafeer spille i å tilrettelegge tumorvekst,studerer cafs har vært en pågående utfordringen grunnet mangel på CAF-spesifikke markører og de aller heterogenitet av disse cellene, med mange subtyper sameksisterende i tumor mikromiljøet 10. Videre studerer fibroblaster in vitro hindret av det faktum at deres genuttrykk profilen er ofte endret i vevskultur 11,12. Å løse dette problemet og for å tillate objektiv gene expression profilering av fibroblaster fra fersk mus og menneskelig vev, har vi utviklet en metode basert på tidligere protokoller for Fluorescence-Activated Cell Sortering (FACS) 13,14. Vår tilnærming er avhengig av å benytte PDGFRα som en overflate markør for å isolere fibroblaster fra frisk mus og menneskelig vev. PDGFRα er rikelig uttrykt av både normale fibroblaster og kafeer 9,15. Denne metoden gjør det mulig isolering av rene bestander av vanlige fibroblaster og kafeer, inkludert, men ikke begrenset til α-SMA + aktivert myofibroblasts. Isolerte fibroblaster kan deretter værebrukt til karakterisering og sammenligning av utviklingen av genuttrykk som oppstår i kafeer under tumorigenesis. Faktisk rapporterte vi og andre uttrykk profilering av fibroblaster isolert av celle sortering 16. Denne protokollen ble vellykket utført for å isolere og profilere høyanriket bestander av fibroblaster fra huden, mammary, bukspyttkjertel og lunge vev. Videre tillater vår metode også dyrking av sortert celler, for å utføre funksjonelle forsøk og for å unngå forurensning av tumorceller, som ofte er en stor hindring ved forsøk til kultur cafs.
Mens eksperimenter utført i vevskultur kan være informative og foreslå funksjonelle prinsipper som kan verifiseres i vivo, er det kjent at store endringer i genekspresjonen av celler i kultur 11,12. For å unngå en vev kultur skritt når profilering av genuttrykk i fibroblaster, utviklet vi en protokoll som gjør det mulig isolering av normale, samt kreft-tilknyttede fibroblaster fra fersk mus eller menneskelig vev. Denne protokollen ble vellykket anvendt med hud, bukspyttkjertel og bryst vev fra…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Yitzchak Oschry og Dr. Orit Sagi-Asif for deres hjelp med FACS sortering. Denne forskningen ble støttet med tilskudd til NE fra EU sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskuddsavtalen n ° [276890], fra Israel Cancer Association (# 20110078), og fra Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM | Gibco | 41965 | |
PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
PharmLyse | BD | 555899 | |
Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |