Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA
Summary
Beschrieben wird ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung Kennzeichnung β-Glucosyltransferase (β-GT), um ein Azid-Glukose zu 5-HMC übertragen, gefolgt von Klickchemie einen Linker Biotin für die einfache und dichteunabhängigen Anreicherung zu übertragen. Dieses effiziente und spezifische Kennzeichnung Methode ermöglicht die Anreicherung von 5-HMC mit extrem niedrigen Hintergrund und hohem Durchsatz epigenomischen Mapping über Next-Generation-Sequenzierung.
Abstract
5-Methylcytosin (5-mC) bildet ~ 2-8% der gesamten Cytosine in humanen genomischen DNA und beeinflusst ein breites Spektrum an biologischen Funktionen, einschließlich Genexpression, die Aufrechterhaltung der Genom Integrität, elterliche Prägung, X-Chromosom-Inaktivierung, die Regulierung des Entwicklung, Alterung und Krebs 1. Kürzlich wurde die Anwesenheit eines oxidierten 5-mC, 5-Hydroxymethylcytosin (5-HMC), in Säugerzellen entdeckt, insbesondere in embryonalen Stamm (ES)-Zellen und neuronalen Zellen 2-4. 5-HMC wird durch Oxidation von 5-mC katalysiert durch TET Familie Eisen (II) / α-Ketoglutarat-abhängige Dioxygenase 2, 3 erzeugt. 5-HMC wird vorgeschlagen, bei der Aufrechterhaltung der embryonalen Stamm (mES) Zelle, normale Hämatopoiese und Tumore und Zygote Entwicklung 2, 5-10 beteiligt sein. Zum besseren Verständnis der Funktion von 5-HMC, ist eine zuverlässige und einfache Sequenzierung von wesentlicher Bedeutung. Traditionelle Bisulfit-Sequenzierung kann nicht unterscheiden, 5-HMC von 5-mC 11 </sup>. Die Biologie des 5-HMC entwirren, haben wir eine hoch effiziente und selektive chemische Ansatz zu kennzeichnen und zu erfassen 5-HMC entwickelt, unter Ausnutzung eines Bakteriophagen Enzym, das einen Glucoserest fügt bis 5-HMC speziell 12.
Hier beschreiben wir eine einfache Zwei-Schritt-Verfahren zur selektiven chemischen Kennzeichnung der 5-HMC. Im ersten Markierungsschritt wird 5-HMC in genomischer DNA mit einem 6-Azid-Glucose katalysiert durch β-GT, eine Glucosyltransferase aus Bakteriophagen T4 bezeichnet, in einer Weise, die das 6-Azid-Glucose überträgt 5-HMC vom modifiziertes Cofaktor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Im zweiten Schritt, Biotinylierung wird ein Disulfid Biotin Linker an die Azidgruppe durch Klickchemie befestigt. Beide Schritte sind hoch spezifisch und effizient, was zu vervollständigen Kennzeichnung unabhängig von der Fülle der 5-HMC in der genomischen Regionen und geben extrem geringe Hintergrund. Nach Biotinylierung von 5-HMC, die 5-HMC-enthaltende DNA-Fragmente werden dann selektiv eingefangenmit Streptavidin-Kügelchen in einer Dichte-unabhängige Weise. Die daraus resultierenden 5-HMC-angereicherte DNA-Fragmente konnten für nachgelagerte Analysen, einschließlich der nächsten Generation Sequenzierung verwendet werden.
Unsere selektive Markierung und Capture-Protokoll überträgt hohe Empfindlichkeit auf jede Quelle der genomischen DNA mit variablem / diverse 5-HMC Häufigkeiten. Obwohl der Hauptzweck dieses Protokolls ist seine nachgeordneten Anwendung (dh. Der nächsten Generation Sequenzierung Karte aus dem 5-HMC Verteilung im Genom), ist es kompatibel mit Einzel-Molekül-, real-time SMRT (DNA)-Sequenzierung, das ist der Lage ist, single-base Auflösung Sequenzierung von 5-HMC.
Protocol
Discussion
5-Hydroxymethylcytosin (5-HMC) ist ein kürzlich identifizierten epigenetische Veränderung in erheblichen Mengen in bestimmten Säugetieren Zelltypen. Das hier vorgestellte Verfahren ist für die Bestimmung der genomweiten Verteilung der 5-HMC. Wir verwenden T4 Bakteriophagen β-glucosyltransferase zur Erzeugung eines manipulierten Glucose-Rest enthaltend eine Azidgruppe auf die Hydroxylgruppe von 5-HMC übertragen. Die Azidgruppe kann chemisch mit Biotin werden zur Feststellung, Affinitätsanreicherung und Sequenzieru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (GM071440 nach CH und NS051630/MH076090/MH078972 PJ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comment |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |
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