Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l'expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4
Summary
Contribution du facteur de remodelage de la chromatine ACF à la mort cellulaire induite par E4orf4 a été mesurée. Le protocole comprend la sélection de clones cellulaires dans lesquelles le traitement doxycycline induit knockdown conditionnelle de sous-unités ACF du Acf1 et SNF2h, et l'utilisation du test DAPI pour mesurer la mort cellulaire induite par E4orf4 dans les lignées cellulaires inductibles.
Abstract
Inactivation fonctionnelle de l'expression des gènes dans les cellules de mammifères est essentielle pour l'étude de la contribution d'une protéine d'intérêt à 1,2 voies différentes. Toutefois, démontable conditionnelle de l'expression du gène est nécessaire dans les cas où knockdown constitutif n'est pas tolérée par les cellules pour une longue période de temps 3-5. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lignées cellulaires permettant knockdown conditionnelle de sous-unités du facteur de remodelage de la chromatine ACF. Ces lignées de cellules de faciliter la détermination de la contribution de ACF à induction de la mort cellulaire par la protéine E4orf4 d'adénovirus 6. Des séquences codant pour les ARN en épingle à cheveux courts pour les sous-unités et Acf1 SNF2h du facteur ACF remodelage de la chromatine ont été clonés à côté d'un promoteur inductible par la doxycycline dans un plasmide contenant un gène également pour le gène de résistance à la néomycine. Clones de cellules résistantes à la néomycine ont été sélectionnées en présence de G418 et isolées. Les lignées de cellules résultants ont été induite partraitement par la doxycycline, et une fois Acf1 ou les niveaux d'expression SNF2h ont été réduits, les cellules ont été transfectées avec un plasmide codant pour E4orf4 ou un vecteur vide. Pour confirmer l'effet spécifique des constructions shRNA, la teneur en protéines Acf1 ou SNF2h ont été restaurés à des niveaux WT par co-transfection avec un plasmide exprimant Acf1 ou SNF2h qui ont été rendues résistantes à l'shRNA par l'introduction de mutations silencieuses. La capacité de E4orf4 pour induire la mort des cellules dans les différents échantillons a été déterminée par un dosage DAPI, dans lequel la fréquence d'apparition des noyaux avec des morphologies apoptotiques dans la population de cellules transfectées a été mesurée 7-9.
Le protocole décrit ici peut être utilisé pour la détermination de la contribution fonctionnelle des différentes protéines à l'induction de la mort cellulaire par leurs partenaires protéiques dans les cas où knockdown constitutif peut être mortelle cellule.
Protocol
Discussion
Knockdown de l'expression génique spécifique est une approche importante pour l'enquête de la contribution d'une protéine de voies de régulation. Depuis knockdown de l'expression constitutive de gènes essentiels affecte négativement la prolifération cellulaire, leur étude peut exiger soit l'introduction transitoire de siRNA ou l'application de systèmes stables knockdown conditionnelles. Génération de lignées cellulaires stables avec la capacité d'origine médicamenteuse expressi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financée (en partie) par la Fondation ISRAEL SCIENCES (Grant 399/11), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre de la coopération germano-israélienne Projet (DIP), et par l'Institut de la famille Rappaport pour la recherche en des sciences médicales.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
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