Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod
Summary
Beitrag des ACF Chromatin-Remodeling Faktor E4orf4-induzierten Zelltod wurde gemessen. Das Protokoll umfasst Selektion von Zellklonen, in denen Doxycyclin Behandlung induziert bedingten Knockdown des ACF-Untereinheiten und Acf1 SNF2h, und die Verwendung des Assay E4orf4 DAPI-induzierten Zelltod in den induzierbaren Zelllinien messen.
Abstract
Funktionelle Inaktivierung der Genexpression in Säugetierzellen ist für die Untersuchung der Beitrag eines Proteins von Interesse, um verschiedene Bahnen 1,2. Jedoch wird bedingten Knockdown der Genexpression in Fällen erforderlich, wenn konstitutive Knockdown nicht durch Zellen für einen langen Zeitraum 3-5 toleriert. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Zelllinien erlaubt bedingten Knockdown Untereinheiten des ACF Chromatin-Remodeling-Faktor. Diese Zelllinien erleichtern die Bestimmung des Beitrags von ACF, um die Induktion des Zelltodes durch das Adenovirus-Protein E4orf4 6. Sequenzen, die für kurze Haarnadel RNAs und für die Acf1 SNF2h Untereinheiten des ACF Chromatin-Remodeling-Faktor wurden neben einer Doxycyclin-induzierbaren Promotors in einem Plasmid auch ein Gen enthält, das für Neomycin-Resistenz-Gen kloniert. Neomycin-resistente Zellklone wurden in Gegenwart von G418 und getrennt ausgewählt. Die resultierenden Zelllinien wurden durch induzierteDoxycyclin-Behandlung, und einmal Acf1 oder SNF2h Expressionsniveaus wurden reduziert, wurden die Zellen mit einem Plasmid E4orf4 oder einem leeren Vektor transfiziert. Um die spezifische Wirkung der shRNA Konstrukte zu bestätigen, wurden Acf1 oder SNF2h Proteinniveaus zu WT Ebenen durch Kotransfektion mit einem Plasmid exprimieren Acf1 oder SNF2h die gegen das shRNA gemacht wurden durch Einführen stiller Mutationen wiederhergestellt. Die Fähigkeit von E4orf4 zum Zelltod in den verschiedenen Proben zu induzieren, wurde durch eine DAPI-Assay, in dem die Häufigkeit des Auftretens von Keimen mit apoptotischen Morphologien in der transfizierten Zellpopulation 7-9 gemessen wurde.
Die hier beschriebene Protokoll kann zur Bestimmung der funktionellen Beitrag verschiedener Proteine, um die Induktion des Zelltods durch ihre Proteinpartner in Fällen verwendet werden, wenn konstitutive Knockdown-Zelle tödlich sein kann.
Protocol
Discussion
Knockdown der Genexpression ist ein wichtiger Ansatz zur Untersuchung des Beitrags von einem Protein zu Regulationswege. Da konstitutive knockdown der Expression von essentiellen Genen wirkt sich negativ auf Zellproliferation, können ihr Studium erfordern entweder vorübergehende Einführung von siRNAs oder Anwendung von stabilen bedingte knockdown Systeme. Erzeugung stabiler Zelllinien mit der Fähigkeit zur Arzneimittel-induzierter Expression von shRNAs hier beschrieben, bietet einen Vorteil gegenüber transienten Tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt (teilweise) der Israel Science Foundation (Grant 399/11), von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des deutsch-israelischen Projektkooperation (DIP), und durch die Rappaport Family Institute for Research in der Medizinischen Wissenschaften.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B’ subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
