Preparação de linhagens de células para Knockdown condicional da expressão gênica e mensuração dos efeitos Knockdown em E4orf4 morte celular induzida por
Summary
Contribuição do factor de remodelação da cromatina ACF para E4orf4 morte celular induzida foi medida. O protocolo inclui a selecção de clones de células na qual o tratamento doxiciclina induz knockdown condicional do subunidades ACF Acf1 e SNF2h, e utilização do ensaio para medir DAPI E4orf4 morte celular induzida em linhas celulares indutíveis.
Abstract
Inactivação funcional da expressão de genes em células de mamíferos é crucial para o estudo da contribuição de uma proteína de interesse a 1,2 caminhos diversos. No entanto, knockdown condicional da expressão do gene é necessária nos casos em que knockdown constitutivo não é tolerada pelas células durante um período longo de tempo 3-5. Aqui descrevemos um protocolo para a preparação de linhas de células que permitem knockdown condicional de subunidades do factor de remodelação da cromatina ACF. Estas linhas de células de facilitar a determinação da contribuição de ACF a indução da morte celular pela proteína E4orf4 de adenovirus 6. As sequências que codificam os ARN em gancho de cabelo curto para as subunidades Acf1 SNF2h e do factor de remodelação da cromatina ACF foram clonados ao lado de um promotor induzível por doxiciclina num plasmídeo que também contém um gene para o gene de resistência à neomicina. Clones de células resistentes à neomicina foram seleccionadas na presença de G418 e isolado. As linhas celulares resultantes foram induzidas pelatratamento doxiciclina, e uma vez que os níveis de expressão ou Acf1 SNF2h foram reduzidos, as células foram transfectadas com um plasmídeo codificando E4orf4 ou um vector vazio. Para confirmar o efeito específico dos construtos shRNA, os níveis de proteínas ou Acf1 SNF2h foram restaurados para os níveis WT por co-transfecção com um plasmídeo que expressa ou Acf1 SNF2h que foram tornadas resistentes ao shRNA pela introdução de mutações silenciosas. A capacidade de E4orf4 para induzir a morte das células nas diferentes amostras foi determinada por um ensaio de DAPI, em que a frequência de aparecimento de núcleos apoptóticos com morfologias, na população de células transfectadas foi medida 7-9.
O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para a determinação da contribuição funcional de várias proteínas para a indução da morte celular pelos seus parceiros de proteína nos casos em que pode ser constitutiva knockdown célula letal.
Protocol
Discussion
Knockdown da expressão do gene específico é uma abordagem importante para a investigação da contribuição de uma proteína de vias reguladoras. Desde knockdown constitutivo de expressão de genes essenciais afeta negativamente a proliferação de células, o estudo pode exigir a introdução ou transitória de siRNAs ou aplicação de sistemas estáveis knockdown condicionais. A geração de linhagens de células estáveis com a capacidade para a expressão induzida por fármacos de shRNAs aqui descrit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado (em parte) pela ciência ISRAEL FUNDAÇÃO (Grant 399/11), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) no âmbito do Projeto de Cooperação O alemão-israelense (DIP), e pelo Instituto da Família Rappaport de Investigação em de Ciências Médicas.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
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