Een Moleculaire Uitlezen van lange termijn Olfactorische aanpassing in<em> C. elegans</em
Summary
Hier beschrijven we een moleculaire uitlezing van langdurige geur aanpassing<em> Caenorhabditis elegans</em>. De Protein Kinase G, EGL-4 is nodig voor een stabiele aanpassingsmaatregelen in de primaire sensorische neuron pair genoemd AWC. Tijdens langdurige geur blootstelling EGL-4 translokeert van het cytosol naar kern van de AWC.
Abstract
Tijdens langdurige stimulatie meeste sensorische neuronen zullen hun reactie van afnemende gevoeligheid van het signaal. De aanpassing reactie helpt vorm aandacht en ook beschermt de cellen tegen over-stimulatie. Aanpassing in de olfactorische circuit van C. elegans werd eerst beschreven door Colbert en Bargmann 1,2. Hier de auteurs gedefinieerde parameters van de olfactorische aanpassing paradigma, dat ze vroeger een genetische screen ontwerpen te isoleren mutanten gebrekkig in hun vermogen tot aanpassing aan vluchtige geuren waargenomen door de cellen Amphid Wing type C (AWC) sensorische neuronen. Bij wildtype C. elegans dieren blootgesteld aan een aantrekkelijke AWC-waargenomen geur 3 voor 30 min zij hun gevoeligheid aan de geur en worden dan genegeerd aanpassing geur in een assay voor chemotaxis gedrag ~ 1 uur. Bij wildtype C. elegans dieren blootgesteld aan een aantrekkelijke AWC-waargenomen geur voor ~ 1 uur zij dan de aanpassing geur ac negerenhemotaxis gedrag assay voor ~ 3 uur. Deze twee fasen van olfactorische aanpassing C. elegans werden beschreven als korte termijn olfactorische aanpassing (geïnduceerd na 30 min geur blootstelling), en op lange termijn olfactorische aanpassing (geïnduceerd na 60 min geur blootstelling). Later werk van L'Etoile et al.., 4 ontdekt een Proteïne Kinase G (PKG) genoemd EGL-4 die nodig is voor zowel de korte termijn en lange termijn olfactorische aanpassing in AWC neuronen. De EGL-4 eiwit een nucleaire lokalisatie sequentie die nodig is voor langdurige geur aanpassingsmaatregelen maar overbodig voor kort olfactorische aanpassingsmaatregelen in de AWC 4. Door tagging EGL-4 met een groen fluorescerend eiwit, kon de lokalisatie van EGL-4 in de AWC tijdens langdurige geur blootstelling visualiseren. Met deze volledig functioneel GFP-gemerkte EGL-4 (GFP :: EGL-4) molecuul hebben we een moleculaire uitlezing van langdurige geur aanpassing in de AWC 5 ontwikkelen. Gebruik van deze molecular uitlezing van olfactorische aanpassing hebben we in staat geweest om zowel vooruit als achteruit genetische screens uit te voeren om mutante dieren die defect subcellulaire lokalisatie patronen van GFP :: EGL-4 exposeren in de AWC 6,7 identificeren. Hier beschrijven we: 1) de constructie van GFP :: EGL-4 tot expressie dieren 2) het protocol voor het kweken van dieren voor langdurige geur geïnduceerde kerntranslocatie assays en 3) het scoren van de langdurige geur geïnduceerde nucleaire translocatie evenement en herstel (her-sensibilisatie) van de nucleaire GFP :: EGL-4 staat.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geur-geïnduceerde nucleaire invoer van een GFP-gelabelde EGL-4 molecuul hier beschreven levert een robuuste moleculaire uitlezing van olfactorische aanpassing in C. elegans. De geur geïnduceerde kerntranslocatie assays zijn eenvoudig en slechts een paar dagen voorbereidingstijd. De pyIs500 dier dat we hebben gemaakt voor deze assays, geeft een marker die de AWC neuron en de GFP-expressie gelabeld EGL-4 eiwit verlicht. Zo hebben we het gevoel dat een experimentator met weinig tot geen ervaring in h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Scott Hamilton, en leden van de O'Halloran lab bedanken voor zorgvuldige lezing van dit manuscript. We danken ook onze anonieme reviewer voor uitstekende suggesties en inzichtelijke commentaar.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
References
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
- L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
- O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
- O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
- L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71 (1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).
