사용하여 DNA의 손상 세키의 연구<em> Xenopus</em> 달걀 압축을 풉니 다
Summary
Xenopus 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점을 조사 할 수있는 유용한 모델 시스템입니다. 이 프로토콜은 Xenopus의 알 추출물과 DNA 손상 검사 점 유도 시약의 준비입니다. 이 기술은 DNA 손상 검사 점 신호의 연구에서 DNA 손상 방식의 다양한에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
매일, 세포 내생과 환경 모욕 다양한를 받게됩니다. 이러한 모욕을 방지하기 위해, 세포가 DNA 손상에 DNA 손상 및 직접 세포 반응을 감지 할 수있는 감시 장치로 신호 DNA 손상 검사 점을 발전시켜 왔습니다. DNA 손상 검사 점 신호 (그림 1)에 참여 센서, 트랜스 듀서 및 effectors라는 단백질의 여러 그룹이 있습니다. 이 복잡한 신호 경로에서 ATR (ATM 및 Rad3 관련)은 DNA 손상 및 복제 스트레스에 응답 할 수있는 주요 kinases 중 하나입니다. 활성화 ATR은 Chk1 아니라 그 하류 기판 (세키 키나제 1) phosphorylate 할 수 있습니다. 따라서, phosphorylated 및 세포주기 체포, 전사 활성화, DNA 손상 수리 및 apoptosis 또는 노화 (그림 1)을 포함하여 DNA 손상 검사 점의 여러 다운 스트림 효과 Chk1 리드를 활성화. DNA가 손상되면 unrep에서 DNA 손상 검사 점 결과를 활성화하기 위해 실패방송 손상과, 이후, 게놈 불안정성. DNA 손상 검사 점의 연구는 세포 게놈 무결성을 유지하는 방법 명료하게하다와 같은 암 등 인간의 질병이 개발 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다.
Xenopus laevis 계란 추출물은 DNA 손상 검사 점의 연구에 강력한 셀 – 무료 추출 모델 시스템으로 등장하고 있습니다. 저속 추출물 (LSE)가 처음 Masui 그룹 1에 의해 설명되었다. DNA 한 번 세포주기 당 semiconservative 방식으로 복제 핵 형성에 LSE 결과 demembranated 정자 염색질의 추가.
ATR/Chk1-mediated 검사 점 신호 경로는 DNA가 손상되거나 복제 스트레스를 2로 실행됩니다. DNA 손상 접근 방식과 DNA 손상 – 모방 구조 3 : 두 가지 방법은 현재 DNA 손상 검사 점을 유발하는 데 사용됩니다. DNA 손상은 자외선 (UV) 조사, γ-방사선, 메틸 나게 의해 유도 될 수esulfonate (MMS), 미토 마이신 C (MMC), 4 nitroquinoline-1-산화물 (4 NQO) 또는 aphidicolin 3, 4. MMS는 DNA 복제를 억제하고 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점은 4-7 활성화 alkylating 요원입니다. UV 조사는 또한 ATR/Chk1-dependent DNA 손상 검사 점 8 트리거합니다. DNA 손상 - 모방 구조 AT70 두 oligonucleotides 폴리 (DA) 70 폴리 (DT) 70 annealed 복잡합니다. AT70 시스템은 빌 Dunphy의 연구실에서 개발 된 널리 9-12 ATR/Chk1 검사 점 (Checkpoint) 신호를 유도하는 데 사용됩니다.
여기, 우리는 (2) DNA 손상 – 모방 구조를 준비하기 위해 두 개의 서로 다른 DNA 손상 방식 (MMS와 UV), (3) Xenopus의 정자 염색질을 치료하는 세포 무료 달걀 추출물 (LSE)를 준비하는 프로토콜은 (1) 설명 AT70, 그리고 (4) 손상된 정자 염색질 또는 DNA 손상 - 모방 구조 LSE에 ATR/Chk1-mediated DNA 손상 검사 점을 실행할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
Xenopus 계란 추출물을 사용하여 DNA 손상 검사 점을 연구의 몇 가지 장점이 있습니다. 계란 추출물의 사용은 세포주기의 계면에서 동기화 셀 – 무료 추출물 대량를 제공합니다. 계란 추출물 쉽게 저렴한 비용으로 만들 수 있습니다. 이 DNA 나 염색질을 손상하고 계란 추출물에서 대상 단백질을 immunodepleting 후 DNA 손상 검사 점의 결함을 나타 내기 위해 상대적으로 쉽습니다. 그 후, 잠재적 인 기?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 샬롯 노스 캐롤라이나 대학 교수 우수성 Wachovia 기초 기금, 그리고 NIGMS (R15GM101571)에서 교부금에 의해 제공 자금에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Reagents | |||
| Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
| Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
| Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
| Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
| Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
| hCG | Sigma | CG10-10VL | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
| Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
| Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
| Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
| PMSG | Calbiochem | 367222 | |
| Sample buffer | Sigma | S3401 | |
| Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
| Equipment | |||
| Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
| CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
| HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
| Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
| Solutions | |||
| 1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
| Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
| Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
| Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
| ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
| Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
| Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
| Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
| Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |
References
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