Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em> Xenopus</em> Os extratos de ovos

Summary

Xenopus egg extracto é um sistema modelo útil para investigar o checkpoint danos no DNA. Este protocolo é para a preparação de extractos de ovos de Xenopus e os danos do ADN reagentes indutores de ponto de verificação. Estas técnicas são adaptáveis ​​a uma variedade de abordagens que danificam o ADN no estudo da sinalização checkpoint danificam o DNA.

Abstract

Numa base diária, as células são sujeitas a uma variedade de insultos endógenos e ambientais. Para combater esses insultos, as células desenvolveram posto de controle de danos ao DNA sinalização como um mecanismo de vigilância para detectar danos no DNA e diretos respostas celulares a danos no DNA. Há diversos grupos de proteínas chamados sensores, transdutores e efetores envolvidos na sinalização de DNA checkpoint de dano (Figura 1). Neste caminho complexo de sinalização, ATR (ATM e Rad3-relacionados) é uma das quinases importantes que podem responder a danos no ADN e stress replicação. Activated ATR pode fosforilar os seus substratos a jusante, tais como o Chk1 (Ponto de verificação quinase 1). Consequentemente, fosforiladas e activadas Chk1 conduz a muitos efeitos a jusante do ponto de verificação, incluindo danos no DNA paragem do ciclo celular, a activação da transcrição, reparação de danos do ADN, e a apoptose ou senescência (Figura 1). Quando o DNA é danificado, não para ativar o DNA resultados checkpoint danos em unrepdanos ao ar e, posteriormente, instabilidade genômica. O estudo dos danos de ADN do ponto de verificação será elucidar como as células a manter a integridade do genoma e proporcionar um melhor entendimento de como as doenças humanas, tais como o cancro, se desenvolver.

Extratos de ovos de Xenopus laevis estão surgindo como um poderoso modelo de sistema livre de células extrato no DNA pesquisa checkpoint danos. De baixa velocidade de extracto (LSE) foi inicialmente descrita por grupo Masui ^1. A adição de cromatina espermática demembranated para os resultados na formação de núcleos de LSE, onde o DNA é replicado em uma forma semiconservativa uma vez por ciclo celular.

A via de sinalização ATR/Chk1-mediated checkpoint é acionado por dano de DNA ou estresse replicação ^2. Dois métodos são usados ​​atualmente para induzir o posto danos ao DNA: abordagens de DNA e DNA danos prejudiciais imitando-estruturas ^3. Dano do ADN pode ser induzida por irradiação com ultravioleta (UV), γ-irradiação, metil metanesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido de (4-NQO), ou afidicolina ^{3, 4.} O MMS é um agente alquilante que inibe a replicação do DNA e ativa o ponto de verificação danos ATR/Chk1-mediated DNA ^4-7. Irradiação UV também provoca a ATR/Chk1-dependent DNA ⁸ checkpoint danos. A estrutura de ADN que imita dano-AT70 é um complexo de recozido de dois oligonucleótidos de poli-(dA) 70 e poli-(dT) 70. O sistema AT70 foi desenvolvido no laboratório Bill Dunphy e é amplamente utilizada para induzir a sinalização de checkpoint ATR/Chk1 ^9-12.

Aqui, nós descrevemos protocolos (1) para preparar extractos isentos de células de ovos (LSE), (2) para o tratamento de Xenopus com cromatina de esperma dois ADN diferentes abordagens danificar (MMS e UV), (3) para preparar o DNA de danos estrutura imita AT70, e (4) para accionar o ponto de verificação ATR/Chk1-mediated danos no DNA LSE com cromatina espermática danificado ou uma estrutura de ADN que imita danos.

Protocol

1. Preparação LSE Rãs do sexo feminino (Xenopus laevis) são injetadas duas vezes para coleta de ovos. A primeira injecção (ferragem) é de 100 U PMSG (gonadotrofina de égua prenhe) por sapo. Rãs deve ser preparada pelo menos dois dias antes de ovo indução assentamento e rãs condicionadas são utilizáveis ​​por até duas semanas. Para rãs primos, injetar por via subcutânea PMSG nos sacos linfáticos dorsal usando uma seringa de 3 ml e 27 agulha G. Para induzir a postura de …

Discussion

Existem várias vantagens em estudar o posto danos no DNA utilizando extratos de Xenopus ovo. A utilização de extractos de ovo fornece uma grande quantidade de extractos livres de células sincronizadas em interfase do ciclo celular. Os extractos de ovos pode ser feita fácil e barata. É relativamente fácil para danificar o DNA ou cromatina e revelar um defeito no ponto de verificação, após danos no ADN immunodepleting uma proteína alvo a partir de extracto de ovo. Subsequentemente, um defeito da funç?…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.