Xenopus oeuf extrait est un système modèle utile pour étudier le point de contrôle de dommages à l'ADN. Ce protocole est destiné à la préparation d'extraits d'œufs de xénope et de l'ADN réactifs induisant des dommages aux points de contrôle. Ces techniques sont adaptables à une variété d'approches endommageant l'ADN dans l'étude de la signalisation checkpoint dommages de l'ADN.
Sur une base quotidienne, les cellules sont soumises à une variété d'insultes endogènes et environnementaux. Pour lutter contre ces insultes, les cellules ont évolué checkpoint dommages à l'ADN de signalisation comme un mécanisme de surveillance afin de détecter les dommages de l'ADN et directs réponses cellulaires aux dommages à l'ADN. Il ya plusieurs groupes de protéines appelés capteurs, transducteurs et des effecteurs impliqués dans la signalisation checkpoint dommages de l'ADN (figure 1). Dans cette voie de signalisation complexe, ATR (ATM et Rad3 liée) est l'un des principaux kinases qui peuvent répondre aux dommages à l'ADN et le stress de réplication. Activé ATR peut phosphoryler ses substrats en aval tels que Chk1 (Checkpoint kinase 1). Par conséquent, phosphorylée et activée Chk1 conduit à de nombreux effets en aval sur le check-point dommages à l'ADN, y compris l'arrêt du cycle cellulaire, activation de la transcription, réparation de l'ADN et l'apoptose ou la sénescence (Figure 1). Lorsque l'ADN est endommagé, ne pas activer les dommages à l'ADN des résultats de points de contrôle dans unrepdommages aéré et, par la suite, l'instabilité génomique. L'étude du point de contrôle dommages à l'ADN permettront d'élucider comment les cellules de maintenir l'intégrité du génome et de fournir une meilleure compréhension de la façon dont les maladies humaines telles que le cancer, se développer.
Xenopus laevis extraits d'œufs sont en train de devenir un puissant système acellulaire modèle extrait dans la recherche checkpoint dommages de l'ADN. À basse vitesse extrait (LSE) a été initialement décrite par le groupe Masui 1. L'ajout de la chromatine des spermatozoïdes demembranated aux résultats LSE dans la formation des noyaux où l'ADN est répliqué de façon semiconservative une fois par cycle cellulaire.
La voie de signalisation ATR/Chk1-mediated point de contrôle est déclenché par lésions de l'ADN ou 2 stress réplicatif. Deux méthodes sont actuellement utilisées pour induire le point de contrôle de dommages à l'ADN: approches endommageant l'ADN et l'ADN des dommages imitant les structures 3. Altération de l'ADN peut être induite par les rayons ultraviolets (UV), γ-irradiation, méthyle méthaneesulfonate (MMS), la mitomycine C (MMC), 4-nitroquinoléine-1-oxyde (4-NQO), ou aphidicoline 3, 4. MMS est un agent alkylant qui inhibe la réplication de l'ADN et active le point de contrôle des dommages l'ADN ATR/Chk1-mediated 4-7. Irradiation UV déclenche également la 8 ADN ATR/Chk1-dependent dommages checkpoint. L'ADN des dommages-imitant la structure AT70 est un complexe recuit de deux oligonucléotides poly-(dA) 70 et le poly-(dT) 70. Le système AT70 a été développé dans le laboratoire Bill Dunphy et est largement utilisé pour induire ATR/Chk1 signalisation aux points de contrôle 9-12.
Ici, nous décrivons les protocoles (1) pour préparer des extraits d'œufs exempts de cellules (LSE), (2) pour traiter la chromatine des spermatozoïdes de Xenopus avec deux ADN différents endommager les approches (MMS et UV), (3) pour préparer l'ADN des dommages imitant la structure AT70, et (4) pour déclencher le point de contrôle des dommages dans l'ADN ATR/Chk1-mediated LSE avec la chromatine de sperme endommagé ou un dommage d'ADN-imitant la structure.
Il ya plusieurs avantages à étudier le point de contrôle de dommages à l'ADN en utilisant Xenopus extraits d'œufs. L'utilisation d'extraits d'oeufs fournit une grande quantité d'extraits exempts de cellules synchronisées en interphase du cycle cellulaire. Les extraits d'oeufs peuvent être facilement et économiquement faite. Il est relativement facile à endommager l'ADN ou de la chromatine et de révéler un défaut dans le poste de contrôle de dommages de l'ADN apr…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail est soutenu en partie par des fonds fournis par l'Université de Caroline du Nord à Charlotte, Wachovia Fondation Caisse d'excellence faculté, et une subvention de NIGMS (R15GM101571).
Reagents | |||
Anti-Chk1 P-S344 antibody | Cell Signaling | 2348L | |
Anti-Chk1 antibody | Santa Cruz | SC7898 | |
Aprotinin | MP Biomedicals | 0219115880 | |
Cycloheximide | Sigma | C7698-5G | |
Cytochalasin B | EMD | 250233 | |
Dithiothreitol (DTT) | VWR | JTF780-2 | |
hCG | Sigma | CG10-10VL | |
L-Cysteine | Sigma | C7352-1KG | |
Leupeptin | VWR | 97063-922 | |
Methyl methanesulfonate (MMS) | Sigma | 129925-5G | |
Nocodazole | Sigma | M1404-2MG | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Sample buffer | Sigma | S3401 | |
Tautomycin | Wako Chemicals USA | 209-12041 | |
Equipment | |||
Bucket for egg laying | Rubbermaid commercial products | 6308 | |
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 004260F | |
HB6 swinging bucket rotor | Thermo Scientific | 11860 | |
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
UV crosslinker | UVP | 95-0174-01 | |
Solutions | |||
1x MMR | 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH | ||
Aprotinin/Leupeptin stock | 10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C. | ||
Buffer X | 0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl | ||
Cycloheximide stock | 10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
Cytochalasin B stock | 5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C. | ||
Dithiothreitol (DTT) stock | 1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C. | ||
ELB | 0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 | ||
Nocodazole stock | 10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C. | ||
Energy Mixture | 375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C. | ||
Nuclear dye solution | 0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS | ||
Tautomycin stock | 100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C. |