صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب
Summary
تصور الخلايا الفردية في أنسجة كثيفة معبأة، مثل خلايا شوان محطة (SCS) عند التقاطعات العصبي العضلي (NMJs)، يمثل تحديا. "متتابع الصورة تبيض" يسمح ترسيم الطوائف المنبوذة محطة واحدة، على سبيل المثال في يزدرع المثلثية العضلات القص، مريحة للأعصاب العضلات إعداد، حيث يمكن الجمع بين متتابعة تبيض مع الوقت الفاصل بين التصوير و<em> ما بعد خاصة</em> immunostainings.
Abstract
متتابعة الصورة تبيض يوفر طريقة غير الغازية لتسمية اللجان الدائمة الفردية في NMJ. وNMJ هي أكبر المشبك الجهاز العصبي في الثدييات وكانت بمثابة توجيه نموذج لدراسة بنية ووظيفة متشابك. في NMJs محطات الماوس محور عصبي السيارات على شكل مواقع الاتصال المملح مع مثل ألياف العضلات. ومغلفة محور عصبي السيارات ومحطة من قبل اللجان الدائمة. على مدى العقود الماضية، وقد ولدت الفئران المعدلة وراثيا لتصور العديد من الخلايا العصبية الحركية والطوائف المنبوذة، على سبيل المثال Thy1-1 و XFP حزب العمال التقدمي-GFP الفئران 2، على التوالي.
على طول محاور عصبية المحرك، يتم ترتيب الطوائف المنبوذة في محور عصبي myelinating السلاميات غير متداخلة، مفصولة العقد من رانفييه، لتمكين قفزي نشر إمكانات العمل. في المقابل، محطة الطوائف المنبوذة في المشبك هي خلايا الدبقية المتخصصة، والتي رصد وتعزيز العصبي، وهضم الحطام محاور عصبية دليل تجديد. وتغطي بإحكام NMJs بنسبة تصل إلى نصف دزينة غير myelinating الطوائف المنبوذة محطة – هذه، ولكن، لا يمكن أن تحل بشكل فردي عن طريق المجهر الضوئي، كما هي على اتصال مباشر الغشاء 3.
توجد عدة أساليب لتصور فردي الطوائف المنبوذة المحطة الطرفية. أي من هذه لا تشوبه شائبة، وإن كان. على سبيل المثال، صبغ شغل، حيث مخوزق الخلايا واحدة ذات صبغة مسرى مكروي مملوءة، يتطلب تدمير خلية العلامات قبل ملء ثانية واحدة. هذا غير متوافق مع مرور الزمن التسجيلات اللاحقة 3. وقد تحقق متعددة الأطياف "Brainbow" توسيم الطوائف المنبوذة باستخدام التعبير اندماجي من البروتينات الفلورية 4. ومع ذلك، هذه التقنية يتطلب الجمع بين عدة جينات منقولة وتحد من نمط التعبير من المروجين المستخدمة. في المستقبل، قد التعبير عن البروتينات "للتحويل الصور" في الطوائف المنبوذة تكون بعد آخر 5 بديلة. هنا نقدم الصورة تبيض متتابعة، حيث يتم تبييض الخلايا واحدة، وصورتهم التي حصلت عليها الطرح. نعتقدأن هذا النهج – نظرا لسهولة وبراعة – يمثل إضافة دائم لوحة تكنولوجيا الأعصاب، وخاصة أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي ونقل إلى أنواع الخلايا الأخرى، والمواقع التشريحية أو الأنواع 6.
في البروتوكول التالية، ونحن من التفصيل تطبيق متتابعة تبيض واللاحقة الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر لمحطة الطوائف المنبوذة في المثلثية إإكسبلنتس العضلات القص. وقد ثبت هذا رقيقة، وتشريح سطحي بسهولة العصبي العضلي إعداد دراسات مفيدة ل7،8 التنمية NMJ، علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض 9. وأخيرا، فإننا شرح كيفية إعداد العضلات القص بعد تثبيت المثلثية لأداء عالية الدقة ترتبط مبائر التصوير، أو الامتحانات التركيبية المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تبيض SC المعروضة هنا هي بسيطة وسريعة وتنوعا: (ط) إنه يمكن الكشف عن واحدة SC مورفولوجيا وديناميات بواسطة المجهر متحد البؤر بناء على التحوير واحدة – وهي ميزة كبيرة عندما الجمع بين نهج سبيل المثال مع نماذج المرض التي تتطلب الأليلات إضافية . (الثاني) والطريقة السر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مانويلا بوداك، Marinkovi ليليانا وWullimann كريستينا للمساعدة التقنية الممتازة. نشكر W. ماكلين لتقديم حزب العمال التقدمي-GFP الفئران. ويدعم TM من قبل معهد الدراسات المتقدمة (جامعة ميونخ التقني)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG؛ Sonderforschungsbereich SFB 596)، من قبل الكسندر فون همبولت، ومؤسسة، وكالة التمويل الوطني ("Bundesministerium FÜR Bildung اوند Forschung" ) في إطار ERA-الصافي "iPSoALS" الخلايا العصبيه و"الفوتون التصوير 2-". ويتم دعم TM MB من قبل مركز علوم البروتين المتكامل (ميونيخ). وأيد PM بواسطة كلية الدراسات العليا للجامعة ميونخ التقني (TUM-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
