Sekventiel fotoblegende at afgrænse Single Schwann-celler ved den neuromuskulære overgang
Summary
Visualisering individuelle celler i tætpakkede væv, såsom terminale Schwann-celler (SCS) i neuromuskulære junctions (NMJs), er udfordrende. "Sekventiel fotoblegende" tillader afgrænse enkelt terminal SCS, for eksempel i triangularis sterni muskel eksplantation, en bekvem nerve-muskel forberedelse, hvor sekventiel blegning kan kombineres med time-lapse imaging og<em> Post-hoc</em> Immunostainings.
Abstract
Sekventiel fotoblegende giver en ikke-invasiv måde at mærke individuelle SCs på NMJ. Den NMJ er den største synapsen af det mammale nervesystem og har fungeret som ledende model til at studere synaptisk struktur og funktion. I muse NMJs motor axon terminaler i kringle-lignende kontakt sites med muskelfibre. Motoren axon og dens terminal er beklædt med SCs. I de sidste årtier er adskillige transgene mus blevet genereret at visualisere motorneuroner og SCS, for eksempel Thy1-XFP 1 og PLP-GFP-mus 2, hhv.
Langs motoriske axoner, er myelinerende axonale SCs anbragt i ikke-overlappende staengelled, adskilt af knudepunkter i Ranvier, så saltatory virkningspotentiale formering. I modsætning hertil er terminale SCs ved synapsen specialiserede gliaceller, der overvåger og fremme neurotransmission, fordøje debris og vejledning regenererende axoner. NMJs er tæt dækket med op til et halvt dusin ikke-myeldelse terminale SCs – disse imidlertid ikke individuelt løses ved lysmikroskopi, når de er i direkte kontakt med membranen 3.
Adskillige fremgangsmåder eksisterer til individuelt at visualisere terminale SCs. Ingen af disse er fejlfri, selv om. For eksempel kræver farvestof fyldning, hvis enkelte celler bliver spiddet med et farvestof fyldt mikroelektrode, ødelægger et mærket celle før fyldning af en anden. Dette er ikke foreneligt med efterfølgende tidsforskudte optagelser 3. Multispektral "Brainbow" mærkning af SCs er opnået ved hjælp af kombinatorisk ekspression af fluorescerende proteiner 4. Denne teknik kræver at kombinere flere transgener, og er begrænset af ekspressionsmønsteret af de anvendte promotorer. I fremtiden kan udtryk af "foto-omstillelige" proteiner i SCs være endnu et alternativ 5. Her præsenterer vi sekventiel fotoblegende, hvor enkelte celler bleges, og deres image fås ved subtraktion. Vi menerat denne tilgang – på grund af dens lethed og alsidighed – betegner en varig over neurolog teknologi paletten, især da den kan anvendes in vivo og overføres til andre celletyper, anatomiske steder eller arter 6.
I det følgende protokol, detalje vi anvendelsen af sekventielle blegning og efterfølgende konfokal time-lapse mikroskopi til terminal SCs i triangularis sterni muskel eksplantater. Denne tynde, overfladiske og nemt dissekeret nerve-muskel forberedelse 7,8 har vist sig anvendelige til undersøgelser af NMJ udvikling, fysiologi og sygdomslære 9. Endelig vil vi forklare hvordan den triangularis sterni musklen fremstilles efter fiksering at udføre korreleret høj opløsning konfokal billedbehandling, immunhistokemi eller ultrastrukturelle undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
SC blegning metode, der præsenteres her er enkel, hurtig og alsidig: (i) Den gør det muligt at afsløre en enkelt SC morfologi og dynamik ved konfokal mikroskopi baseret på en enkelt transgen – hvilket er en betydelig fordel, når man kombinerer den tilgang med f.eks sygdomsmodeller, der kræver yderligere alleler . (Ii) Fremgangsmåden er hurtig, fra dissektion til fiksering den kan udføres på en halv dag. (Iii) Antallet af ansøgninger er bred, da det kan kombineres med andre metoder, såsom celle ablati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi og Kristina Wullimann for fremragende teknisk bistand. Vi takker W. Macklin til tilvejebringelse af PLP-GFP-mus. TM er støttet af Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), som Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich SFB 596), af Alexander-von-Humboldt-Fonden og den nationale bevilgende myndighed ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) inden for rammerne af ERA-Net neuron "iPSoALS" og "2-foton billedbehandling". TM og MB understøttes af Center for Integreret Protein Science (München). PM blev støttet af Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
