Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate
Summary
Sichtbarmachen einzelner Zellen in dicht gepackten Geweben wie terminalen Schwann-Zellen (SCs) an neuromuskulären Endplatten (NMJs), ist eine Herausforderung. "Sequential Fotobleichen" ermöglicht die Abgrenzung einzigen Terminal SCs, zum Beispiel in der triangularis sterni Muskel Explantat, eine bequeme Nerv-Muskel-Präparat, wo sequenzielles Bleichen mit Zeitraffer-Aufnahmen kombiniert werden können und<em> Post-hoc</em> Immunfärbungen.
Abstract
Sequentielle Photobleichen stellt eine nicht-invasive Methode zur individuellen SCs im NMJ etikettieren. Die NMJ ist die größte Synapsen des Nervensystems der Säuger-System und ist als Leitbild zur synaptischen Struktur und Funktion zu untersuchen serviert. In Maus NMJs Motors Axonterminalen bilden Brezel-like Kontaktstellen mit Muskelfasern. Der Motor Axon und sein Terminal werden von SCs ummantelt. In den vergangenen Jahrzehnten haben mehrere transgene Mäuse generiert, um Motoneuronen und SCs visualisieren, zum Beispiel Thy1-XFP 1 und Plp-GFP Mäusen 2.
Motor entlang Axone werden myelinisierenden axonalen SCs in nicht überlappenden Internodien angeordnet, getrennt durch Knoten Ranvier, um saltatorische Aktionspotential Ausbreitungsrichtung aktivieren. Im Gegensatz dazu sind Endgerät SCs an der Synapse spezialisierten Gliazellen, welche zu überwachen und zu fördern Neurotransmission, verdauen Schutt und Führung regenerierenden Axone. NMJs eng um bis zu einem halben Dutzend nicht MYEL abgedecktinating Endgerät SCs – dies kann jedoch nicht durch Lichtmikroskopie individuell aufgelöst werden, da sie in direktem Kontakt Membran 3 befinden.
Mehrere Ansätze existieren individuell visualisieren Terminal SCs. Keiner von ihnen sind makellos, though. Zum Beispiel erfordert Farbstoff Füllung, wobei einzelne Zellen mit einem Farbstoff gefüllten Mikroelektrode aufgespießt werden, Zerstören eines markierten Zelle vor dem Befüllen eine zweite. Dies ist nicht kompatibel mit anschließender Zeitraffer-Aufnahmen 3. Multispektrales "Brainbow" Kennzeichnung von SCs ist durch Verwendung kombinatorischer Expression von fluoreszierenden Proteinen 4 erreicht. Allerdings erfordert diese Technik, die mehrere Transgene und wird durch die Expressionsmuster der verwendeten Promotoren beschränkt. In Zukunft könnte Ausdruck "photoschaltbare" Proteine in SCs noch eine andere alternative 5 sein. Hier präsentieren wir sequentielle Fotobleichen, wo einzelne Zellen gebleicht werden, und ihr Image durch Subtraktion erhalten. Wir glauben,dass dieser Ansatz – aufgrund seiner Einfachheit und Vielseitigkeit – eine dauerhafte Neben der Neurowissenschaftler Technologie-Palette, zumal es in vivo verwendet werden können und auf andere übertragen Zelltypen, anatomischen oder Arten 6.
In dem folgenden Protokoll, Detail wir die Anwendung der sequentiellen Bleichen und anschließende konfokale Zeitraffer-Mikroskopie an Klemme SCs in triangularis sterni Muskel-Explantaten. Diese dünne, oberflächliche und einfach zerlegt Nerv-Muskel-Präparat 7,8 hat sich für ein Studium der NMJ Entwicklung, Physiologie und Pathologie 9 nützlich. Schließlich erklären wir, wie die triangularis sterni Muskeln bereit ist nach der Fixierung durchzuführen korreliert hochauflösende konfokale Bildgebung, Immunhistochemie oder ultrastrukturelle Untersuchungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der SC Bleichen hier vorgestellte Methode ist einfach, schnell und vielseitig: (i) Es ermöglicht enthüllt einzigen SC Morphologie und Dynamik durch konfokale Mikroskopie auf einer einzigen Transgen basiert – und das ist ein wesentlicher Vorteil bei der Kombination der Ansatz z. B. mit der Krankheit Modelle, die zusätzliche Allele erfordern . (Ii) Das Verfahren ist schnell, wie aus Dissektion zur Fixation in einem halben Tag durchgeführt werden kann. (Iii) Die Anzahl der Anwendungen ist breit, wie es mit and…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi und Kristina Wullimann für hervorragende technische Unterstützung danken. Wir danken W. Macklin für die Bereitstellung Plp-GFP Mäusen. , Von der Alexander-von-Humboldt-Stiftung und von der nationalen Förderagentur ("Bundesministerium für Bildung und Forschung"; TM wird durch das Institut für Höhere Studien (Technische Universität München), von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG) unterstützt ) im Rahmen des ERA-Net NEURON "iPSoALS" und "2-Photonen-Imaging". TM und MB werden vom Center for Integrated Protein Science (München) unterstützt. PM wurde von der Graduate School der Technischen Universität München (TUM-GS) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
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- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
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- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
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