תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular
Summary
Visualizing תאים בודדים ברקמות דחוסות, כגון תאים סופניים שוואן (SCS) בneuromuscular צמתים (NMJs), מאתגר. "משכית תמונת הלבנה-" מאפשר תיחום SCS מסוף היחיד, למשל בexplant triangularis sterni השריר, הכנה נוחה עצבי שרירים, שם ניתן לשלב הלבנה רציפה עם הדמית זמן לשגות ו<em> פוסט הוק</em> Immunostainings.
Abstract
תמונה רציפה הלבנה-מספק דרך לא פולשנית לתייג SCS הבודד בNMJ. NMJ הוא סינפסה הגדולה ביותר של מערכת העצבים של היונקים וכהן כמנחה מודל ללמוד מבנה ותפקוד הסינפטי. במסופי האקסון מוטורי NMJs עכבר להקים אתרי מגע הבייגלה עם סיבי שריר. מנוע האקסון ומסופו הם המכוסים בSCS. במהלך העשורים האחרונים, מספר עכברים הטרנסגניים כבר נוצר כדי לחזות הנוירונים מוטוריים וSCS, לדוגמא 1 Thy1-XFP ו PLP-GFP עכברים 2, בהתאמה.
לאורך האקסונים מוטוריים, SCS axonal myelinating מסודר בהלא חופף internodes, מופרד על ידי צומת של Ranvier, כדי לאפשר התקדמות פוטנציאל פעולה קופצנית. בניגוד לכך, SCS טרמינל הסינפסה הם תאי גליה מיוחדים, אשר לפקח ולקדם עצביים, לעכל האקסונים מדריך מתחדש ופסולת. NMJs מכוסה היטב על ידי עד חצי תריסר הלא myelinating SCS מסוף – אלה, עם זאת, לא ניתן לפתור באופן אישי על ידי מיקרוסקופ אור, כפי שהם נמצאים בקשר ישיר קרום 3.
כמה גישות קיימות בנפרד לדמיין SCS מסוף. אף אחד מאלה הם ללא רבב, אם כי. לדוגמה, מילוי צבע, שם תאים בודדים הם משופדים עם microelectrode צבע מלא, דורש להרוס את תאים שכותרתו לפני מילוי שנייה אחת. זה אינו תואם עם הקלטות זמן לשגות באות 3. תיוג בעל רפאים "Brainbow" של SCS הושג באמצעות ביטוי קומבינטורית של חלבוני ניאון 4. עם זאת, טכניקה זו דורשת שילוב של מספר transgenes ומוגבל על ידי דפוס הביטוי של היזמים בשימוש. בעתיד, ביטוי של חלבונים "צילום" בהחלפת SCS יכול להיות עוד 5 חלופיים. כאן אנו מציגים צילום הלבנה רציף, שבו תאים בודדים המולבנים, ותמונתם מתקבלת על ידי חיסור. אנו מאמיניםכי גישה זו – בשל הקלות והרבגוניות שלו – מייצגת תוספת קיימא לפלטת הטכנולוגיה של הנוירולוג, במיוחד כפי שהוא יכול להיות בשימוש בגוף חי והועבר לתאים מסוגים אחרים, אתרים או מינים 6 אנטומיים.
בפרוטוקול הבא, אנחנו פירוט היישום של מיקרוסקופיה confocal הלבנה רציפה ולאחר הזמן לשגות לSCS מסוף בexplants השרירים sterni triangularis. הכנה זו דקה, שטחית ונתחה בקלות עצבי שרירי 7,8 הוכיחה שימושית ללימודים של NMJ פיתוח, פיזיולוגיה והפתולוגיה 9. לבסוף, תסבירו כיצד שרירי sterni triangularis מוכנים לאחר הקיבוע לבצע קורלציה רזולוציה גבוהה confocal הדמיה, או בדיקות אימונוהיסטוכימיה ultrastructural.
Protocol
Representative Results
Discussion
SC שיטת ההלבנה מוצגת כאן היא פשוט, מהירה ותכליתית: (i) הוא מאפשר לחשוף מורפולוגיה SC אחת ודינמיקה ידי מיקרוסקופיה confocal מבוססת על transgene בודד – אשר מהווה יתרון משמעותי בעת שילוב לדוגמא הגישה למודלים למחלות הדורשים אללים נוספים . (Ii) היא השיטה מהירה, כמנתיחה לקיבעון זה נ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למנואלת ודאק, Ljiljana Marinkovi וקריסטינה Wullimann לקבלת סיוע טכני מעולה. אנו מודים וו מאקלין למתן עכברי PLP-GFP. TM נתמך על ידי המכון ללימודים מתקדמים (אוניברסיטת Technische מינכן), על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), על ידי אלכסנדר פון הומבולדט–הקרן ועל ידי סוכנות המימון הלאומי ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) במסגרת של "Neuron" iPSoALS ERA-NET ו" הדמית 2-פוטון ". TM וMB נתמכים על ידי המרכז למדע החלבון משולב (מינכן). השעה הייתה נתמכת על ידי בית הספר למוסמכים של אוניברסיטת Technische מינכן (טום-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
