Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare
Summary
Visualizzare le singole celle di densamente tessuti confezionati, come le cellule di Schwann terminali (SC) a giunzioni neuromuscolari (NMJs), è una sfida. "Sequenziale foto-bleaching" permette di delineare SC singolo terminale, per esempio nel triangularis espianto muscolo Sterni, un comodo nervo-muscolo preparazione, dove sequenziale sbiancamento può essere combinato con time-lapse imaging e<em> Post-hoc</em> Immunostainings.
Abstract
Sequenziale foto-sbiancamento fornisce un modo non invasivo per etichettare i singoli CS al NMJ. Il NMJ è il più grande sinapsi del sistema nervoso dei mammiferi ed è servito da guida modello per studiare la struttura e la funzione sinaptica. Nel topo NMJs terminali motore assoni formano pretzel-come siti di contatto con le fibre muscolari. L'assone motore e il terminale sono rivestiti da SCS. Negli ultimi decenni, diversi topi transgenici sono stati generati per visualizzare i motoneuroni e SCS, per esempio Thy1-XFP 1 e Plp-GFP topi 2, rispettivamente.
Lungo assoni motori, mielinizzanti SC assoni sono disposti in internodi non sovrapposte, separate da nodi di Ranvier, per consentire saltatoria propagazione del potenziale d'azione. Al contrario, CS terminali a sinapsi sono specializzate cellule gliali, che monitorano e promuovere la neurotrasmissione, digerire detriti e guida assoni rigeneranti. NMJs sono strettamente coperti fino a una mezza dozzina di non MYELinating SCs terminali – questi, però, non può essere risolto singolarmente al microscopio ottico, in quanto sono in contatto diretto membrana 3.
Esistono diversi approcci per visualizzare singolarmente SC terminale. Nessuno di questi è impeccabile, però. Per esempio, il riempimento colorante, dove sono impalato singole cellule con un colorante pieno microelettrodo, richiede la distruzione di una cellula marcato prima di occupare un secondo. Questo non è compatibile con le successive registrazioni time-lapse 3. Multispettrale etichettatura "Brainbow" di SCS è stato ottenuto utilizzando l'espressione di proteine fluorescenti combinatorio 4. Tuttavia, questa tecnica richiede che unisce transgeni diversi ed è limitato dal pattern di espressione dei promotori utilizzati. In futuro, espressione di "foto-commutabili" proteine CS potrebbe essere ancora un'altra alternativa 5. Qui vi presentiamo in sequenza foto-sbiancamento, in cui le cellule singole sono sbiancati, e la loro immagine ottenuta per sottrazione. Noi crediamoche questo approccio – per la facilità e versatilità – rappresenta un'aggiunta duratura palette tecnologia del neuroscienziato, soprattutto in quanto può essere utilizzato in vivo e trasferito altri tipi cellulari, siti anatomici o specie 6.
Nel seguente protocollo, abbiamo dettaglio l'applicazione sequenziale di sbiancamento e successiva confocale time-lapse microscopia a CS terminali in triangularis espianti muscolari Sterni. Questo sottile, superficiale e facilmente sezionato nervo-muscolo preparazione 7,8 si è dimostrato utile per lo studio di NMJ sviluppo, fisiologia e patologia 9. Infine, viene spiegato come il muscolo triangularis sterni è disposta dopo la fissazione per eseguire correlata ad alta risoluzione imaging confocale, immunoistochimica o esami ultrastrutturali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo SC sbiancamento qui presentato è semplice, veloce e versatile: (i) Permette rivelando singola SC morfologia e dinamiche mediante microscopia confocale basato su un singolo transgene – che è un vantaggio significativo quando si associa l'es approccio con modelli di malattia che richiedono alleli aggiuntivi . (Ii) Il metodo è veloce, come da dissezione del fissaggio può essere eseguito in mezza giornata. (Iii) Il numero di applicazioni è ampio, in quanto può essere combinato con altri metodi, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi e Kristina Wullimann per un'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo W. Macklin per la fornitura di Plp-GFP topi. TM è sostenuto dall'Istituto di Studi Avanzati (Technische Universität München), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), dalla Alexander-von-Humboldt-Foundation e dall'agenzia finanziamenti nazionali ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) nell'ambito di ERA-Net neurone "iPSoALS" e "2-fotoni di imaging". TM e MB sono supportati dal Centro per la Scienza Protein integrata (Monaco di Baviera). PM è stato sostenuto dalla Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
