Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular
Summary
Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. "Sequential foto-branqueamento" permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem e<em> Post-hoc</em> Imunomarcações.
Abstract
Sequencial de foto-branqueamento fornece uma maneira não-invasiva para rotular SCs individuais no NMJ. O NMJ é a maior sinapse do sistema nervoso de mamíferos e serviu como guia modelo para estudar a estrutura e função sináptica. No rato NMJs terminais do motor axônio formar locais pretzel, como contato com as fibras musculares. O axônio motor e seu terminal são revestidos por SCs. Ao longo das últimas décadas, vários ratinhos transgénicos que foram gerados para visualizar os neurónios motores e SCS, por exemplo Thy1-XFP 1 e Plp-GFP ratos 2, respectivamente.
Junto axônios motores, myelinating SCs axonais são dispostos em não sobrepostos entrenós, separados por nós de Ranvier, para permitir a propagação saltatória potencial de ação. Em contraste, a SCS terminais na sinapse são especializados células gliais, que monitoram e promover a neurotransmissão, digerir os detritos e os axônios guia de regeneração. NMJs estão bem cobertos em até meia dúzia de não-mielinating SCs terminais – estes, no entanto, não podem ser resolvidas individualmente por microscopia de luz, uma vez que estão em contacto directo membrana 3.
Diversas abordagens existem para visualizar individualmente SCs terminais. Nenhum destes são impecáveis, embora. Por exemplo, o corante de enchimento, em que as células individuais são empalado com um microeléctrodo de corante-cheia, requer a destruição de uma célula marcada antes do enchimento de um segundo. Esta não é compatível com subseqüentes lapso de tempo gravações 3. Multi-espectral "Brainbow" rotulagem de SCs foi conseguido usando a expressão combinatória de proteínas fluorescentes 4. No entanto, esta técnica requer que combina diversos transgenes e está limitado por o padrão de expressão dos promotores utilizados. No futuro, a expressão de "photo-comutável" proteínas em SC pode ser ainda mais 5 alternativa. Aqui apresenta-se foto-branqueamento sequencial, em que as células individuais são branqueados, e sua imagem obtida por subtracção. Acreditamosque esta abordagem – devido à sua facilidade e versatilidade – representa uma adição duradoura para a paleta neurocientista da tecnologia, especialmente no que pode ser utilizado in vivo e transferido para outros tipos de células, os locais anatómicos e espécies 6.
No protocolo a seguir, detalhes que a aplicação de branqueamento e seqüencial subseqüente microscopia confocal lapso de tempo para SCs terminais em explantes musculares triangularis Sterni. Esta fina, superficial e facilmente dissecados preparação nervo-músculo 7,8 tem se mostrado útil para estudos de NMJ desenvolvimento, fisiologia e patologia 9. Finalmente, vamos explicar como o músculo Sterni triangularis está preparado para executar após a fixação correlacionada de alta resolução de imagem confocal, imunohistoquímica ou exames ultra-estruturais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado SC branqueamento é simples, rápido e versátil: (i) permite revelar a morfologia única e SC dinâmica por meio de microscopia confocal baseado num único transgene – o que é uma vantagem significativa quando se combina a abordagem por exemplo, com modelos de doenças que necessitam de alelos adicionais . (Ii) O método é rápido, a partir de dissecação para a fixação pode ser realizada em meio dia. (Iii) O número de aplicações é vasto, uma vez que pode ser combinado com o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi e Kristina Wullimann para assistência técnica excelente. Agradecemos W. Macklin para fornecer Plp GFP-ratos. TM é apoiada pelo Instituto de Estudos Avançados (Technische Universität München), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), pelo Alexander-von-Humboldt-Foundation e pela agência de fomento nacional ("für Bildung und Bundesministerium Forschung" ) no quadro da ERA-NET neurônio "iPSoALS" e "imagem dois fótons". TM e MB são suportados pelo Centro de Ciência Proteína Integrado (Munique). PM foi apoiado pela Escola de Pós-Graduação da Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
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- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
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- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
