Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular
Summary
Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. "Sequential foto-blanqueamiento" permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiempo y<em> Post-hoc</em> Immunostainings.
Abstract
Secuencial foto-blanqueador proporciona una manera no invasiva para etiquetar SCs individuales en la unión neuromuscular. El NMJ es el mayor sinapsis del sistema nervioso de los mamíferos y ha servido como guía modelo para estudiar la estructura y la función sináptica. En ratón terminales NMJs motor axón formar pretzel-como sitios de contacto con las fibras musculares. El axón motor y su terminal están rodeados por SCS. En las últimas décadas, varias ratones transgénicos se han generado para visualizar las neuronas motoras y SC, por ejemplo Thy1-XFP 1 y Plp-GFP ratones 2, respectivamente.
A lo largo de los axones motores, mielinizantes CSs axonales están dispuestas en que no se solapan entrenudos, separadas por nódulos de Ranvier, para habilitar la propagación saltatoria potencial de acción. En contraste, los CSs de terminales en la sinapsis son células gliales, que supervisar y promover la neurotransmisión, digerir los desechos y los axones de regeneración de guía. NMJs están bien tapado, hasta la mitad de una docena no myelginarios CSs terminales – estos, sin embargo, no puede ser resuelto individualmente por microscopía de luz, ya que están en contacto directo membrana 3.
Existen varios enfoques para visualizar individualmente CSs terminales. Ninguno de estos es impecable, sin embargo. Por ejemplo, el relleno de tinte, donde las células individuales están empalado con un microelectrodo de tinte lleno, necesita destruir una célula marcada antes de llenar un segundo. Esto no es compatible con las posteriores grabaciones con lapso de tiempo 3. Multiespectral "Brainbow" etiquetado de los CSs se ha logrado mediante el uso de la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes 4. Sin embargo, esta técnica requiere la combinación de varios transgenes y está limitada por el patrón de expresión de los promotores usados. En el futuro, la expresión de "foto-conmutables" proteínas en SC podría ser otra alternativa 5. Aquí presentamos secuencial foto-blanqueador, en donde las células individuales son blanqueados, y su imagen obtenida por sustracción. Creemosque este enfoque – debido a su facilidad y versatilidad – representa una adición duradera a la tecnología de la paleta neurocientífico, especialmente en lo que puede ser utilizado in vivo y se transfiere a otros tipos celulares, sitios anatómicos o especies 6.
En el siguiente protocolo, que detalle la aplicación secuencial de blanqueo y posterior confocal de lapso de tiempo microscopía a las SC terminales en explantes de músculo triangularis esternón. Esta delgada, superficial y se diseca fácilmente nervio-músculo preparación 7,8 ha demostrado ser útil para el estudio de NMJ desarrollo, la fisiología y la patología 9. Por último, se explica cómo el músculo triangularis esternón se prepara después de la fijación de realizar una correlación alta resolución de imagen confocal, inmunohistoquímica o exámenes ultraestructurales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de blanqueo SC presentado aquí es sencillo, rápido y versátil: (i) Se permite revelar única morfología SC y dinámica por microscopía confocal basado en un único transgén – lo cual es una ventaja significativa cuando se combina con el enfoque por ejemplo, modelos de enfermedades que requieren alelos adicionales . (Ii) El método es rápido, a partir de la disección para la fijación se puede realizar en un medio día. (Iii) El número de aplicaciones es muy amplio, ya que puede ser combinado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Manuela Budak, Marinkovi Ljiljana y Wullimann Kristina por su excelente asistencia técnica. Damos las gracias a W. Macklin para proporcionar GFP-Plp ratones. TM es apoyado por el Instituto de Estudios Avanzados (Technische Universität München), por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB Sonderforschungsbereich 596), por la Alexander-von-Humboldt-Foundation y por la administración nacional ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) en el marco de ERA-NET NEURON "iPSoALS" y "2-fotón de imagen". TM y MB son apoyados por el Centro para la Ciencia Proteína Integrado (Munich). PM fue apoyado por la Escuela de Postgrado de la Universidad Técnica de Munich (TUM-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
