Sekventiell fotoblekningsreaktion att avgränsa Single Schwann celler vid den neuromuskulära förbindelsen
Summary
Visualisera enskilda celler i tätt packade vävnader såsom terminal Schwann celler (SCS) vid neuromuskulär korsningar (NMJs), är en utmaning. "Sekventiell fotoblekningsreaktion" tillåter avgränsar enda terminal SCS, till exempel i triangularis sterni muskel explantation, en bekväm nerv-muskel preparat, där sekventiell blekning kan kombineras med time-lapse avbildning och<em> Post-hoc</em> Immunostainings.
Abstract
Sekventiell fotoblekningsreaktion ger en icke-invasiv metod för att märka enskilda kaster på NMJ. Den NMJ är den största synapsen av nervsystemet hos däggdjur och har fungerat som vägledande modell för att studera synaptisk struktur och funktion. I mus NMJs motor axon terminaler bildar kringla-liknande kontakt webbplatser med muskelfibrer. Motorn axon och dess terminal mantlade av SC. Under de senaste decennierna har flera transgena möss genererats att visualisera motoriska nervceller och SCS, till exempel Thy1-XFP 1 och PLP-GFP möss 2, respektive.
Längs motor axoner är myeliniserande axonala kaster arrangerade i icke-överlappande internoder, åtskilda av noder av Ranvier att möjliggöra saltatorisk förökning aktionspotential. Däremot terminal kaster i synapsen är specialiserade gliaceller, som övervakar och främjar neurotransmission, smälta skräp och guide regenererande axoner. NMJs är tätt täckt av upp till ett halvdussin icke-LFöPLsprung terminal SCS – dessa kan dock inte vara individuellt lösas genom ljusmikroskop, som de är i direkt membran kontakt 3.
Flera tillvägagångssätt existerar för att individuellt visualisera terminala SC. Ingen av dessa är felfri, dock. Till exempel kräver färg fyllning där enskilda celler spetsad med ett färgämne fylld mikroelektrod, förstöra en märkt cell innan du fyller en andra. Detta är inte förenligt med efterföljande tid-lapse inspelning 3. Multispektralt "Brainbow" märkning av SCS har uppnåtts genom att använda kombinatorisk expression av fluorescerande proteiner 4. Emellertid kräver denna teknik att kombinera flera transgener och begränsas av uttrycksmönstret av de använda promotorerna. I framtiden kan uttryck av "foto-omkopplingsbar" proteiner i kaster vara ytterligare ett alternativ 5. Här presenterar vi sekventiell fotoblekningsreaktion där enskilda celler bleks och deras image som erhålls genom subtraktion. Vi troratt detta tillvägagångssätt – på grund av dess lätthet och mångsidighet – representerar en varaktig tillägg till neuroscientist teknik palett, särskilt som det kan användas in vivo och överförs till andra celltyper, anatomiska platser eller arter 6.
I följande protokoll, detalj vi tillämpningen av sekventiella blekning och efterföljande konfokal tidsförlopp mikroskopi till plint kaster i triangularis sterni muskel explantat. Denna tunna, ytliga och lätt dissekeras nerv-muskel preparat 7,8 har visat sig användbar för studier av NMJ utveckling, fysiologi och patologi 9. Slutligen förklarar vi hur den triangularis sterni muskeln är beredd efter fixering att utföra korrelerade med hög upplösning konfokal avbildning, immunohistokemi eller ultrastrukturella undersökningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
SC blekning metod som presenteras här är enkel, snabb och mångsidig: (i) Det gör att avslöja enda SC morfologi och dynamik genom konfokalmikroskopi baserad på en enda transgen – vilket är en betydande fördel vid kombination av tillvägagångssätt, t.ex. med sjukdomsmodeller som kräver ytterligare alleler . (Ii) Metoden är snabb, från dissekering till fixering kan utföras i en halv dag. (Iii) Antalet ansökningar är bred, eftersom den kan kombineras med andra metoder, såsom cell ablationer, organe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi och Kristina Wullimann för utmärkt tekniskt stöd. Vi tackar W. Macklin för åstadkommande PLP-GFP möss. TM stöds av Institutet för avancerade studier (Technische Universität München), av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich SFB 596), av Alexander-von-Humboldt-stiftelsen och den nationella finansiär ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) inom ramen för ERA-Net NEURON "iPSoALS" och "2-photon imaging". TM och MB stöds av Centrum för integrerad Protein Science (München). PM stöddes av Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
