Passaging nyanser mänskliga embryonala stamceller-linjer med Trypsin

Summary

I denna video visar vi hur våra labb rutinmässigt passager nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer med trypsin.

Abstract

I denna video visar vi hur våra labb rutinmässigt passager nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer med trypsin. Mänskliga embryonala stamceller är artefakter i cellodling, och tenderar att förvärva karyotypic avvikelser med hög befolkning dubbleringar. Korrekt passaging är nödvändig för att upprätthålla en sund, odifferentierad, karyotypically normala nyanser mänskliga embryonala kultur stamceller. För det första är en växande kultur tvättas i PBS för att avlägsna rester media och cellfragment, då cellerna överdragen med en minimal mängd varma 0,05% Trypsin-EDTA. Trypsin är kvar på cellerna i upp till fem minuter, sedan cellerna försiktigt rubbas med en 2 ml serologisk pipett. Cellsuspensionen samlas och blandas med en stor mängd nyanser media, då cellerna samlas in genom försiktig centrifugering. Det inaktiverade trypsin media blandning tas bort och celler resuspenderas i förvärmda nyanser media. En lämplig Delningsfaktorn beräknas (i regel från 1:10 till 1:20), och celler åter klädd på en 1-2 dagar gammal skylt som innehåller ett monolager av bestrålade möss embryonala celler fibroblast mataren. Den nysådda nyanser odlingsplatta lämnas orörd i 48 timmar, då medierna förändras varje dag därefter. Det är viktigt att inte trpsinize ner till en enda cell fjädring, eftersom detta ökar risken för att införa karyotypic avvikelser.

Protocol

Allmänt Vi rekommenderar att tina inte mer än ett prov vid en viss tidpunkt för att säkerställa enkel hantering. Föraren ska se till att inte lämna kulturer vid rumstemperatur och låga CO2 under långa perioder. Alla centrifugering av levande celler sker vid 500-600 xg under 5 minuter vid rumstemperatur. MEFs (Mouse Embryonala Feeder celler) Pre-varm MEF media till 37 ° C. Ta bort MEF flaskan från -80 ° C och omedelbart dränka den nedre halva…

Discussion

I den här videon vi visat hur vi rutinmässigt passagen nyanser mänskliga embryonala stamcellslinjer i vårt laboratorium. Effektiv och regelbunden delning och passaging är nödvändigt för att upprätthålla en sund mänskliga embryonala stamcellslinje. Trypsin medierad passage är en betydande fördel av nyanser cellinjer, är det dock viktigt att inte över trypsinize kulturer eller att ha en stor del av enskilda celler under re-platting.

Materials

HuES media 651.5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6.5 ml GlutaMAXTM 6.5 ml NEAA 6.5 ml 2‐mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng/mL final) 0.65 ml