Vi beskriver framställningen av tunna retinal skivor från vattenlevande tiger salamandrar (<em> Ambystoma tigrinum</em>) Och förklara hur vi använder dessa skivor för att studera synaptisk bearbetning i näthinnan genom att erhålla dubbla hel-cell inspelningar spänningsklämma från fotoreceptorer och andra ordningens horisontella och bipolära celler.
En av de centrala uppgifterna i näthinnan neurovetenskap är att förstå kretsen av näthinnans nervceller och hur dessa anslutningar är ansvariga för utformningen av de signaler som sänds till hjärnan. Fotoner detekteras i näthinnan av tappar och stavar fotoreceptorer, som omvandlar den energin till en elektrisk signal, sänder det till andra näthinnans nervceller, där det bearbetas och kommuniceras till centrala mål i hjärnan via synnerven. Viktiga tidiga insikter i retinal kretsar och visuell bearbetning kom från de histologiska studier av Cajal 1,2 och senare, från elektrofysiologiska inspelningar av tillsatta aktiviteten av näthinneganglieceller – de utgående cellerna i näthinnan 3,4.
En detaljerad förståelse av visuell bearbetning i näthinnan kräver en förståelse av signaleringen vid varje steg i banan från ljusmätare till näthinnegangliecell. Men många retinala celltyper är burlivet djupt inne i vävnaden och därför relativt otillgänglig för elektrofysiologiska inspelning. Denna begränsning kan övervinnas genom att arbeta med vertikala skivor, i vilka celler som är bosatta inom varje retinaskikt är klart synlig och åtkomlig för elektrofysiologiska inspelning.
Här beskriver vi en metod för att göra vertikala sektioner av näthinnor från larver tiger salamandrar (Ambystoma tigrinum). Även detta preparat utvecklades ursprungligen för inspelningar med skarpa microelectrodes 5,6, beskriver vi en metod för dubbla helcells-inspelningar spänningsklämma från fotoreceptorer och andra ordningens horisontella och bipolära celler där vi manipulerar fotoreceptorn membran potential och samtidigt spelar in post- synaptiska svar i horisontella eller bipolära celler. De fotoreceptorer i tiger salamander är betydligt större än däggdjursarter, vilket gör detta till en idealisk förberedelse på sig att genomföra thans tekniskt utmanande experimentella tillvägagångssätt. Dessa experiment beskrivs med ett öga mot sondera signalering egenskaper hos den synaptiska band – en specialiserad synaptisk struktur som finns i en bara en handfull av nervceller, inklusive stav och kon fotoreceptorer, som är väl lämpade för att upprätthålla en hög tonic neurotransmitterfrisättning 7 , 8 – och hur det bidrar till de unika signalering egenskaper hos denna första retinal synaps.
Den retinal slice preparatet har visat sig mycket användbart för att analysera kretsar och mekanismer som näthinnan att bearbeta visuell information. Möjligheten att erhålla hela cellen inspelningar samtidigt från pre-och postsynaptiska neuron har varit särskilt användbart i denna strävan. Kopplade hela celler inspelningar är mycket lättare att uppnå med skivor än med platt-mount näthinnan preparat eftersom de olika näthinnan lagren utsätts för. Dessutom, på grund av deras stora näthinnans nervceller, salamandrar har en lång historia som en retinal förberedelser och ger därför ett särskilt väldefinierade modellorganismer systemet.
Med lite övning kan friska skivor salamander näthinnan framställas regelbundet. Några viktiga steg kan göra skillnaden mellan framgång och misslyckande. 1) Se till att rakbladet är monterad på vävnaden slicer så att den ligger plant mot glasytan och skivor snyggt men både vävnad och underlying nitrocellulosamembran. Om du tagit en rent snitt genom nitrocellulosamembranet, bör du höra ett svagt klickande när rakbladet träffar ytan av ett objektglas. 2) Se till att näthinnan har anslutit sig till nitrocellulosamembranet. Annars kan näthinnan flyta bort från membranet under varje steg av förfarandena. 3) Utsätt inte skurna skivorna till luft, eftersom detta kommer att skada många av de ytliga cellerna. 4) Se till att skivorna och nitrocellulosa membran ligga platt mot glaset bilden så att retinaskikt är uppenbara under dissekera mikroskop. 5) Balansera andelen superfusate inflöde och utflöde för att undvika överfyllda inspelningen kammaren. Detta förhindrar att plötsliga förändringar i lösning nivåer, vilket kan orsaka plötsliga vävnad rörelser. 6) Välj en hälsosam cellpar nära till varandra. Celler med slät cytoplasman är friskare än celler med kornigt cytoplasma. Celler djupare i segmentet är mer benägna att behålla intakt synaptic conkontakter. 7) Kontrollera att pipetten inte har gått sönder eller borstad mot annan vävnad eller skräp på vägen ner till cellerna. 8) Kontrollera pipetten motstånd för att säkerställa att det inte är igensatt med skräp eller en bubbla, som båda kan göra det svårt att erhålla en kvalitet helcells-inspelning.
Snarare än att fästa näthinnan till nitrocellulosa filterpapper, bädda in vissa forskare näthinnor i ett block av agar och använda en vibratom att skära retinal skivor. Även om vi inte har provat denna metod, Kim et al. 11 diskuterar fördelarna med båda tillvägagångssätten. I sina erfarenheter, ger den agar synsätt en mer konsekvent utbyte av platta skivor med väl avgränsade retinaskikt men filterpapper synsätt ger friskare fotoreceptorer.
Stavar och koner är ansvariga för att omvandla ljus till förändringar i membranpotential. Med parade inspelningar, kan membranet potential stavar eller koner vara manipulpade direkt och så förmågan att generera lätta svar, medan användbart för att identifiera celltyper, kanske inte är nödvändigt. Vi därför ofta förbereda skivor i vitt ljus. Men även om den framställs i starkt ljus, kan salamander näthinnans nervceller genererar stora ljusa reaktioner såsom illustreras av svaren i figur. Tre. Detta beror delvis på en relativt stor reservoar av kromofor i den stora yttre segmentet volym men kan också spegla förmåga Müller-celler för att regenerera 11-cis-retinal för koner 12. För att få fullt mörk-anpassade lätta svar, kan man framställa skivorna under infrarött ljus. För dissektioner under infrarött ljus, fäster vi GenIII Bildförstärkare (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) till okularen i dissektionsmikroskop och belysa vävnaden med en LED infraröd ficklampa. För skärning och andra förfaranden som inte bedrivs under dissekera mikroskop, använder vi en head-mounted imaGE intensifier. För placering av plåstret pipetter, visualisera vi skivor med hjälp av en infraröd-känslig CCD-kamera (t.ex. Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) monterad på den upprätt, fast-stage mikroskop. Med dessa försiktighetsåtgärder, kan man få spö svar uppvisar enda foton känslighet 6, 13.
En begränsning av arbetstiden i retinal skivor är att långa cellulära processer av stora fält näthinnans nervceller kan förlora många av sina dendriter under skivning förfarandet. Retinal slice preparat är därför mer användbara för att studera fysiologin hos celler i vilka de synaptiska kontakter involverar processer nära cellkroppen. Amfibie och däggdjur näthinnor delar många av samma celltyper och utnyttja liknande fysiologiska mekanismer 14-16. Medan salamander näthinnan är en bra förebild för många aspekter av däggdjur näthinnan, verkar en viktig skillnad att vara närvaron av en särskild stång väg hos däggdjur som involves kontakter specialiserade stav bipolära celler på AII amakrina celler 14. En ytterligare begränsning av salamander näthinnan är det lilla antal genetiska verktyg som utvecklats speciellt för denna art. Emellertid antikroppar och shRNA reagens som riktar väl konserverade regioner hos andra arter kan användas med framgång i salamander, som kan många små molekylinhibitorer och reagenser peptid. Dessutom, med ett fåtal ändringar i tekniken, kan retinal skivor framställas från andra arter där vissa av dessa verktyg är mer lättillgängliga.
Bortom dess användbarhet för parade hel-cell inspelning, är salamandern näthinnan skiva beredning också bli föremål för en mängd andra metoder. Såsom diskuterats ovan, kan retinal skivor kan användas för att studera lätta svar i kombination med olika protokoll spänningsklämma 17. Näthinnans nervceller kan också laddas med fluorescerande färgämnen känsliga för Ca2 +, Cl -, eller Na+ Infördes genom plåstret pipetten eller genom bad-applikation 15,18-20. En fluorescerande peptid som binder till det synaptiska bandet 21 kan införas genom plåstret pipetten och används för avbildning av bandet 10 eller, när den konjugeras till fluorescein, för akut och selektivt skada bandet 22. Vi har också använt retinal skivor i kombination med kvantprickar att övervaka förflyttningar av enskilda kalciumkanaler på tappar och stavar synaptiska terminaler 23. Således är den vertikala retinal slice en mångsidig experimentell förberedelse för att studera grundläggande synaptiska mekanismerna och de unika funktioner bearbetning som utförs vid första synapsen i det visuella signalväg.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av forskning för att förebygga blindhet och National Institutes of Health bidrag EY10542.
Name of the reagent/material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Tissue slicer | Stoelting | 51425 | |
Double edge razor blades | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
Nitrocellulose membranes | Millipore | AAWP02500 | Type AAWP 0.8 mm pore |
Borosilicate glass pipettes | World Precision Instruments | TW120F-4 | 1.2mm OD 0.95 mm ID |
Ag/AgCl pellet | Warner | E206 | |
MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 ga. Filling needle, 67 mm long |