एक एम्फ़िबियाई रेटिना स्लाइस तैयारी में photoreceptors और दूसरा आदेश न्यूरॉन्स से एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग
Summary
हम जलीय बाघ सैलामैंडर (से पतली रेटिना स्लाइस की तैयारी का वर्णन<em> Ambystoma tigrinum</em>) और हम photoreceptors और दूसरे क्रम क्षैतिज और द्विध्रुवी कोशिकाओं से दोहरी पूरे सेल वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के द्वारा रेटिना में synaptic प्रसंस्करण अध्ययन करने के लिए इन स्लाइस का उपयोग कैसे समझा.
Abstract
One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells – the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor’s membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon – a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 – and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.
Protocol
Representative Results
Discussion
रेटिना टुकड़ा तैयारी circuitry और दृश्य सूचना पर कार्रवाई करने के रेटिना द्वारा नियोजित तंत्र का विश्लेषण करने के लिए बहुत उपयोगी साबित हो गया है. पूर्व और बाद synaptic न्यूरॉन्स से एक साथ पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की क्षमता के इस प्रयास में विशेष रूप से उपयोगी है. अलग रेटिना परतें उजागर कर रहे हैं क्योंकि बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग फ्लैट माउंट रेटिना तैयारी के साथ तुलना स्लाइस के साथ प्राप्त करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं. इसके अलावा, क्योंकि उनके बड़े रेटिना न्यूरॉन्स की, सैलामैंडर एक रेटिना तैयारी के रूप में एक लंबा इतिहास है और इसलिए एक विशेष रूप से अच्छी तरह से विशेषता मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं.
अभ्यास के साथ, समन्दर रेटिना के स्वस्थ स्लाइस नियमित रूप से तैयार किया जा सकता है. कुछ महत्वपूर्ण कदम सफलता और विफलता के बीच अंतर कर सकते हैं. 1) यह सफाई से कांच की सतह और स्लाइस के खिलाफ फ्लैट देता है ताकि धार ऊतक slicer पर मुहिम शुरू की है सुनिश्चित करें कि हालांकि ऊतक और underlyi दोनोंएनजी nitrocellulose झिल्ली. आप nitrocellulose झिल्ली के माध्यम से एक साफ काट दिया है, तो रेजर ब्लेड गिलास स्लाइड की सतह हमलों के रूप में, आप एक बेहोश क्लिक सुनना चाहिए. 2) रेटिना nitrocellulose झिल्ली का पालन किया है सुनिश्चित करें. अन्यथा, रेटिना प्रक्रियाओं के किसी भी कदम के दौरान झिल्ली से तैर कर सकते हैं. 3) इस सतही कोशिकाओं के कई नुकसान होगा, हवा को काट स्लाइस बेनकाब मत करो. 4) रेटिना परतों विदारक खुर्दबीन के नीचे स्पष्ट कर रहे हैं ताकि स्लाइस और nitrocellulose झिल्ली गिलास स्लाइड के खिलाफ फ्लैट झूठ सुनिश्चित करें. 5) रिकॉर्डिंग कक्ष बह निकला से बचने के क्रम में superfusate प्रवाह और बहिर्वाह की दरों को संतुलित करें. इस अचानक ऊतक आंदोलनों का कारण बन सकती है, जो समाधान के स्तर में अचानक परिवर्तन, रोकता है. 6) एक दूसरे के करीब की कोशिकाओं का एक स्वस्थ जोड़ी का चयन करें. चिकनी कोशिका द्रव्य के साथ कोशिकाओं दानेदार कोशिका द्रव्य के साथ कोशिकाओं से स्वस्थ हैं. टुकड़ा में गहरी कोशिकाओं बरकरार अन्तर्ग्रथनी चोर को बनाए रखने की संभावना हैtacts. 7) पिपेट टिप कोशिकाओं के रास्ते पर टूट या अन्य ऊतक या मलबे के खिलाफ धकेल दिया नहीं गया है सुनिश्चित करें. 8) यह मलबा या यह मुश्किल एक गुणवत्ता के पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं, जो दोनों के एक बुलबुला, से भरा हुआ नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए पिपेट प्रतिरोध की जाँच करें.
बल्कि nitrocellulose, फिल्टर पेपर के लिए रेटिना संलग्न की तुलना में, कुछ जांचकर्ताओं अगर एक ब्लॉक में retinas एम्बेड और रेटिना स्लाइस में कटौती के लिए एक vibratome का उपयोग करें. हम इस दृष्टिकोण की कोशिश नहीं की है, किम एट अल. 11 दोनों दृष्टिकोण के लाभों पर चर्चा. अपने अनुभव में, अगर आधारित दृष्टिकोण अच्छी तरह चित्रित रेटिना परतों के साथ फ्लैट स्लाइस की एक और अधिक सुसंगत उपज प्रदान करता है, लेकिन फिल्टर पेपर आधारित दृष्टिकोण स्वस्थ फोटोरिसेप्टर पैदावार.
छड़ और शंकु झिल्ली क्षमता में परिवर्तन में प्रकाश transducing के लिए जिम्मेदार हैं. बनती रिकॉर्डिंग के साथ, छड़ या शंकु की झिल्ली संभावित manipul हो सकता हैप्रकार की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उपयोगी है, जबकि आवश्यक नहीं हो सकता है, सीधे और इतने हल्के प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने की क्षमता पैदा. इसलिए हम अक्सर सफेद रोशनी में स्लाइस तैयार करते हैं. छवि में प्रतिक्रियाओं से यह साफ है फिर भी, जैसा चमकदार रोशनी के तहत तैयार की गई है, जब भी समन्दर रेटिना न्यूरॉन्स बड़े प्रकाश प्रतिक्रियाओं उत्पन्न कर सकते हैं. 3. इस बड़े बाहरी खंड मात्रा में क्रोमोफोर की एक अपेक्षाकृत बड़े जलाशय की वजह से है, लेकिन यह भी शंकु 12 के लिए 11-सीआईएस रेटिना को पुनर्जीवित करने मुलर कोशिकाओं की क्षमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. पूरी तरह से काले अनुकूलित प्रकाश प्रतिक्रियाओं प्राप्त करने के लिए, एक अवरक्त रोशनी के तहत स्लाइस तैयार कर सकते हैं. अवरक्त प्रकाश के तहत dissections के लिए, हम विदारक माइक्रोस्कोप के oculars के लिए GenIII छवि intensifiers (Nitemate NAV3, Litton इंडस्ट्रीज, Tempe, AZ) देते हैं और एक अवरक्त एलईडी टॉर्च के साथ ऊतक रोशन. टुकड़ा करने की क्रिया और विदारक माइक्रोस्कोप के तहत आयोजित नहीं कर रहे हैं कि अन्य प्रक्रियाओं के लिए, हम एक सिर पर चढ़कर भारतीय सैन्य अकादमी को रोजगारजीई intensifier. पैच pipettes के प्लेसमेंट के लिए हम ईमानदार, निश्चित अवस्था खुर्दबीन के लिए मुहिम शुरू की एक अवरक्त के प्रति संवेदनशील सीसीडी कैमरा (जैसे Watec 502H, Watec इंक, मिडलटाउन, हिन्दी अनुवाद) का उपयोग स्लाइस कल्पना. इन सावधानियों के साथ, एक फोटान संवेदनशीलता 6, 13 प्रदर्शन रॉड प्रतिक्रियाएं प्राप्त कर सकते हैं.
रेटिना स्लाइस में काम करने की एक सीमा है कि बड़े क्षेत्र रेटिना न्यूरॉन्स की लंबी सेलुलर प्रक्रियाओं टुकड़ा करने की प्रक्रिया के दौरान उनके dendrites के कई खो सकता है. रेटिना टुकड़ा तैयारी इसलिए synaptic संपर्कों सेल शरीर के करीब प्रक्रियाओं शामिल है जिसमें कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए अधिक उपयोगी होते हैं. उभयचर और स्तनधारी retinas के एक ही प्रकार की कोशिकाओं के कई हिस्सा है और इसी तरह के शारीरिक तंत्र 14-16 उपयोग. समन्दर रेटिना स्तनधारी रेटिना के कई पहलुओं के लिए एक अच्छा मॉडल है, एक महत्वपूर्ण अंतर यह है कि स्तनधारियों में एक समर्पित रॉड मार्ग की उपस्थिति प्रतीत होता है कि invoअजमेर amacrine कोशिकाओं 14 पर विशेष छड़ी द्विध्रुवी कोशिकाओं के lves संपर्क. समन्दर रेटिना की एक और सीमा इस प्रजाति के लिए विशेष रूप से विकसित आनुवंशिक उपकरण की छोटी संख्या है. हालांकि, अन्य प्रजातियों में लक्ष्य अच्छी तरह से संरक्षित क्षेत्रों के समन्दर में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है कि एंटीबॉडी और shRNA अभिकर्मकों, के रूप में कर सकते हैं कई छोटे अणु inhibitors और पेप्टाइड अभिकर्मकों. इसके अतिरिक्त, तकनीक में कुछ संशोधनों के साथ रेटिना स्लाइस इन उपकरणों में से कुछ अधिक आसानी से उपलब्ध हैं, जिसमें अन्य प्रजातियों से तैयार किया जा सकता है.
बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए इसकी उपयोगिता से परे, समन्दर रेटिना टुकड़ा तैयारी भी अन्य दृष्टिकोण की एक किस्म के लिए उत्तरदायी है. ऊपर चर्चा की, रेटिना स्लाइस विभिन्न वोल्टेज क्लैंप प्रोटोकॉल 17 के साथ संयोजन में प्रकाश प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रेटिना न्यूरॉन्स भी 2 सीए के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लोड किया जा सकता है +, सी.एल. -, या ना+ पैच विंदुक के माध्यम से या स्नान आवेदन 15,18-20 द्वारा शुरू की. अन्तर्ग्रथनी रिबन 21 को बांधता है कि एक फ्लोरोसेंट पेप्टाइड पैच विंदुक के माध्यम से पेश किया है और जब fluorescein संयुग्मित, तीव्रता और चुनिंदा रिबन 22 को नुकसान पहुँचाए के लिए इमेजिंग रिबन 10 या, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम भी छड़ी पर व्यक्तिगत कैल्शियम चैनल और कोन synaptic टर्मिनलों 23 की गतिविधियों पर नजर रखने के लिए क्वांटम डॉट्स के साथ संयोजन में रेटिना स्लाइस का इस्तेमाल किया है. इस प्रकार, ऊर्ध्वाधर रेटिना टुकड़ा बुनियादी अन्तर्ग्रथनी तंत्र और दृश्य संकेत मार्ग में पहली synapse में प्रदर्शन अद्वितीय प्रसंस्करण कार्यों के अध्ययन के लिए एक बहुमुखी प्रयोगात्मक तैयारी है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम दृष्टिहीनता और स्वास्थ्य अनुदान EY10542 के राष्ट्रीय संस्थानों को रोकने के लिए अनुसंधान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of the reagent/material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue slicer | Stoelting | 51425 | |
| Double edge razor blades | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | AAWP02500 | Type AAWP 0.8 mm pore |
| Borosilicate glass pipettes | World Precision Instruments | TW120F-4 | 1.2mm OD 0.95 mm ID |
| Ag/AgCl pellet | Warner | E206 | |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 ga. Filling needle, 67 mm long |
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