Summary

Ventricular derecha sistólica mediciones de presión en combinación con la cosecha de pulmón y muestras de tejido inmune en ratones

Published: January 16, 2013
doi:

Summary

Un protocolo específico y rápido para investigar simultáneamente la función del corazón derecho, inflamación pulmonar, y la respuesta inmune que se describe como una herramienta de aprendizaje. Vídeo y figuras describen la fisiología y técnicas de microdisección en un equipo organizado-enfoque que es adaptable para ser utilizado para pequeñas y grandes estudios de tamaño.

Abstract

La función del corazón derecho es bombear sangre a través de los pulmones, uniendo así la fisiología del corazón derecho y la fisiología vascular pulmonar. La inflamación es un modificador común de corazón y la función pulmonar, mediante la elaboración de la infiltración celular, la producción de citoquinas y factores de crecimiento, y mediante el inicio de procesos de remodelación 1.

En comparación con el ventrículo izquierdo, el ventrículo derecho es una bomba de baja presión que funciona en una zona relativamente estrecha de los cambios de presión. El aumento de la presión arterial pulmonar se asocian con aumento de la presión en el lecho vascular pulmonar y la hipertensión pulmonar 2. La hipertensión pulmonar se asocia a menudo con enfermedades pulmonares inflamatorias, por ejemplo enfermedad pulmonar obstructiva crónica, o enfermedades autoinmunes 3. Dado que la hipertensión pulmonar confiere un mal pronóstico para la calidad de vida y la esperanza de vida, mucha investigación se dirige hacia la comprensión de los mecanismos que might ser blanco de 4 intervención farmacéutica. El principal desafío para el desarrollo de herramientas de gestión eficaces para la hipertensión pulmonar sigue siendo la complejidad de la comprensión simultánea de los cambios moleculares y celulares en el corazón derecho, los pulmones y el sistema inmunológico.

Aquí, se presenta un flujo de trabajo de procedimiento para la medición rápida y precisa de los cambios de presión en el corazón derecho de ratones y la cosecha simultánea de muestras de corazón, los pulmones y los tejidos inmunes. El método se basa en la cateterización directa del ventrículo derecho a través de la vena yugular en estrecha de pecho ratones, desarrollado por primera vez en la década de 1990 como medida indirecta de la presión en la arteria pulmonar 5-13. El equipo organizó enfoque facilita una técnica muy rápida cateterismo cardíaco derecho. Esto hace que sea posible llevar a cabo las mediciones en los ratones que espontáneamente respirar aire de la habitación. La organización del flujo de trabajo en distintas áreas de trabajoreduce el tiempo de retardo y abre la posibilidad de realizar simultáneamente experimentos de fisiología y tejidos cosecha corazón inmune, y pulmón.

El flujo de trabajo del procedimiento descrito aquí se puede adaptar para una amplia variedad de entornos de laboratorio y diseños de estudio, a partir de experimentos pequeñas y enfocadas, a grandes ensayos de selección de fármacos. La adquisición simultánea de datos en fisiología cardiaca que se puede ampliar para incluir la ecocardiografía 5,14-17 y cosecha de los tejidos del corazón, pulmón e inmune reduce el número de animales necesarios para obtener los datos que se mueven a la base de conocimientos científicos adelante. El flujo de trabajo de procedimiento que aquí se presenta también proporciona una base ideal para el conocimiento de las redes que vinculan a pulmón inmune y la función cardiaca. Los mismos principios descritos aquí pueden adaptarse para estudiar otros órganos o adicional según sea necesario.

Protocol

1. Preparación Preparar las siguientes soluciones y tubos (Tabla 1) como sigue: Hanks solución, sin calcio, magnesio o indicador con penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml). Salina tamponada con fosfato (PBS), 1x, calcio no, magnesio no. Etanol, 70%, hacer 500 ml. Buffered formaldehído, un 7-10% con PBS, hacer 500 ml. Anestesia soluciones: Avertin. Añadir cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribro…

Representative Results

El resultado primario para la obtención de curvas de presión derecho del corazón se logra por la posición correcta del catéter en el corazón derecho. La forma de las curvas de presión de tiempo es crítico porque la correcta colocación del catéter dentro del ventrículo derecho se traducirá en mesetas de presión (Figura 4). Curvas de punta, en cambio, indican un catéter que se mueve por la respiración o el movimiento latido del corazón contra la pared del ventrículo derecho. Para detectar…

Discussion

El flujo experimental descrito aquí permite la medición rápida y simultánea de la presión sistólica del ventrículo derecho y la cosecha de las muestras para el análisis de las respuestas en los pulmones, el corazón y el sistema inmune en ratones. El procedimiento combina mediciones cardíacas fisiología, micro-disección y posterior cosecha de tejidos para estudios de células vivas, el análisis histológico o ómicas-análisis de los tejidos. El procedimiento completo tarda menos de 20 min por ratón. Debido…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), American Heart Association, filial Fundadores (0855943D, GG); Stony Wold – Herbert Fondo, Nueva York (SHP).

Materials

Name Company Catalogue number Comments (optional)
Reagents
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463
2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402
disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) Fisher Scientific 1629-08
Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade PHARMCO-AAPER 111000200 Dilute to 70 % with distilled water
Formaldehyde solution Sigma-Aldrich F1635-500ML Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water
Hanks solution, no calcium, magnesium Fisher Scientific 21-022-CV
O.C.T Tissue-Tek 4583
Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution Thermo Scientific SV30010
Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions Fisher Scientific
Sodium pentobarbital 26% Fort Dodge Animal Health NDC 0856-0471-01
Labware
Plates 12, 24, 96 well Falcon
Transfer Pipet Fisher Scientific 13-711-9BM
Tube, EDTA coated Sarstedt 2013-08
Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge VWR
Tubes 12 x 75 mm polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D
Tubes, various sizes, polypropylene Fisher Scientific
Instruments
Forceps, Dumon #5 Fine Fine Science Tools 11254-20
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved Fine Science Tools 11152-10
Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight Fine Science Tools 11150-10
Cannula 18 ga, 19 ga BD Precision Glide Needles Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface.
Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm Fine Science Tools 14081-09
Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 Fine Science Tools SP116
Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 Teleflex medical 18020-60
Syringe, 1 ml BD 309659
Equipment
Amplifier, PowerLab 4/30 ADInstrument Model ML866
Catheter, pressure F1.4 Millar Instruments, Inc 840-6719
Dissecting Microscope Variscope
Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades Fine Science Tools 15000-00
Halogen Illuminated Desk Magnifier Fisher Scientific 11-990-56
Laptop computer Asus Model number A52F i5 processor; 15 inch
Light Source Amscope HL-250-A
Pressure Control Unit Millar Instruments, Inc PCU-2000
Software, Labchart-Pro V.7 AD Instruments

References

  1. Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
  2. Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
  3. Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
  4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
  5. Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
  6. Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
  7. Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
  8. West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
  9. Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
  10. West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
  11. Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
  12. Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
  13. Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
  14. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
  15. Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
  16. Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
  17. Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
  18. Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
  19. Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
  20. Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
  21. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
  22. Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
  23. Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
  24. Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
  25. Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
  26. Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
  27. Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
  28. Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
  29. Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).

Play Video

Cite This Article
Chen, W., Park, S., Hoffman, C., Philip, C., Robinson, L., West, J., Grunig, G. Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice. J. Vis. Exp. (71), e50023, doi:10.3791/50023 (2013).

View Video