En ny teknik för att skapa en reproducerbar<em> In vivo</em> Modell av livmoderhalscancer ryggmärgen skärsår skada i musen beskrivs. Denna teknik är baserad på ryggraden stabilisering genom fixering av de cervikala fasetter och laceration av ryggmärgen med användning av en oscillerande blad med en noggrannhet av ± 0,01 mm.
Användning av genetiskt modifierade möss ökar vår förståelse av molekylära mekanismer bakom flera neurologiska sjukdomar som en ryggmärgsskada (SCI). Freehand manuell styrning används för att producera ett skärsår modell av SCI skapar inkonsekventa skador ofta förknippas med en fruktdryck eller kontusion komponent och därför behövdes en ny teknik utvecklats. Vår modell av livmoderhalscancer skärsår SCI har löst inneboende svårigheter med frihand metoden genom att införliva 1) livmoderhalscancer vertebral stabilisering av ryggraden aspekt fixering, 2) ökad ryggmärgen exponering, och 3) skapande av en reproducerbar skärsår av ryggmärgen med en oscillerande klinga med en noggrannhet av ± 0,01 mm i djup utan associerad kontusion. Jämfört med de vanliga metoderna för att skapa en SCI skärsår såsom frihand användning av en skalpell eller sax, har vår metod fram en konsekvent lesion. Denna metod är användbar för studier av axonal återbildning av corticospnalet, rubrospinala och dorsala stigande skrifter.
Tillgången på genetiskt modifierade möss är ett kraftfullt verktyg för att identifiera effekterna av specifika gener som spelar en roll i mekanismerna för SCI. Laceration SCI är en viktig modell som används för att undersöka terapeutiska medel eller molekyler som kan ge effektiv behandling efter denna skada 8. Fixering av spinalutskotten under skapandet av skärsår skada i möss är otydlig på grund av svårigheten att förstå de tunna och sköra spinous processer med upprätthållande spinalfixering 5,11. Variationen i djupet av laceration av endast 0,2 mm (10% av diametern av musen ryggmärgen) orsakar missledande tolkning av data. Arten och omfattningen av ryggmärgen laceration lesion måste definieras 10. För att möta denna utmaning, har vi utvecklat en ny teknik som består av vertebral stabilisering och använde påhittade blad bifogas Louisville Injury System Apparat (LISA) för att producera en laceration SCI 7,14. Denna skada har skapats med hjälp av en kraftig oscillerande kniv som undvek vävnad deformation under laceration processen. Djupet av laceration var exakt med en noggrannhet av 0,01 mm genom att använda mikro-drivrutiner som styr laceration djupet. Kapskivor är skräddarsydda för specifika former och bredder för att skapa den önskade laceration konturen 9. Vi demonstrerar 1) metoden för halsryggen exponering, 2) tekniken med vertebral stabilisering med hjälp av en bilateral enhet fasett fixering, och 3) att skapa en livmoderhalscancer skärsår skada med ett vibrerande blad.
Vertebral stabilisering innan skärsår skador på ryggmärgen har erhållits genom fixering av spinalutskotten. Både halsryggen lordotiska kurva och fastsättning av klämmor till spröda korta livmoderhalscancer spinalutskotten från C3 till T1 i musen förhindra effektiv rygg stabilisering. Vidare användning av ett rakblad eller microscissors utnyttjas under manuell kontroll orsakar betydande vävnad deformation som skapar variation i djupet av lesionen 6. Detta kan leda till feltolkning av data speciellt när axonal regeneration av specifika vägar studeras. Exempelvis kan besparas dorsala corticospinal axoner misstolkas som regenererade axoner om den dorsala kortikospinala tarmkanalen inte var helt transekterades vid tidpunkten för lesionering. Dessa utmaningar kan övervinnas med hjälp av en anordning rygg stabilisering med fixering till fasetter på en enda nivå och exakt lesionering av ryggmärgen. Dessutom använder ahigh frekvens oscillerande blad ger en skarp skärsår utan att krossa eller contusing intilliggande ryggmärgen. Denna metod har använts för att framställa ryggmärgsskador skärsår i råtta 9,12,14, med efterföljande ändringar producera bröstkorg ryggmärgen sår i möss 6. I detta meddelande beskriver vi metoden för att skapa tillförlitliga livmoderhalscancer skärsår lesioner i musen.
I den mån den anteroposteriora diametern av ryggmärgen är <2 mm i musen, exakta djupet av laceration lesionen är avgörande för att skapa en tillförlitlig experimentell modell. Minimal variabilitet i lesionen djupet kommer att avsevärt ändra resultaten av experiment utvärderar axonregeneration samt volymetrisk och beteendestudier. Noggrannheten för lesionen djup med hjälp av denna metod är ± 0,01 mm eftersom vi använt hög precision mikroelement för att styra läget hos skärbladet. Denna metod har minskat inkonsekvens iHerent på andra modeller för att skapa ett skärsår SCI. Denna metod är särskilt användbar för att studera axonal återbildning av den långa ryggmärgen vägar ligger i den dorsala hälften av ryggmärgen, såsom kortikospinala tarmkanalen, det rubrospinala tarmkanalen och den dorsala uppstigande tarmkanalen. Med denna metod kan dessa fiberområden vara fullständigt och tillförlitligt transected. I detta avseende är oriktig tolkning av data minimeras, och därigenom förbättra tillförlitligheten i rapporteringen av experimentella studier på SCI.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en ny teknik för att skapa en reproducerbar in vivo-modell av cervikal ryggmärg laceration skada i mus. Denna teknik är baserad på ryggraden stabilisering genom fixering av de cervikala fasetter och laceration av ryggmärgen med användning av en oscillerande kniv. Med denna metod i en rygg bröstkorg ryggmärgen skärsår hos möss 6 visade vi en stram korrelation mellan laceration djupet, histologi, ochbeteende återhämtning. En sådan teknik har även visat sig vara tillförlitliga av flera andra laboratorier 2,12.
The authors have nothing to disclose.
Utvecklingen av denna enhet stöddes av LISA Co, Louisville, Kentucky. Vi erkänner också den pågående stöd för Norton Healthcare, Louisville, KY till CBS, och NIH NS050243, NS052290 och NS059622 till XMX.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. |