우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데 사용되었습니다 1.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC) 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 방법은 가능한 연속 다섯 분 시간 창 동안 한 셀에서 생산되는 단백질 분자의 숫자를 계산 할 수 있습니다. 이 라이브 셀에 하나의 형광 단백질 분자를 감지 할 충분히 문자를 구분합니다 ~ 0.5-1 kW 급 / cm 2,의 레이저 여기 전력 밀도와 형광 현미경이 필요합니다. 막 타겟팅 순서, 빠른 속도로 성장하고, 노란색 형광 단백질과 단백 분해 효소 인식 순서 :이 방법에 사용되는 형광 기자는 세 부분으로 구성되어 있습니다. 기자는 translationally 관심 단백질의 N-말단에 융합되어 있습니다. 셀은 온도 조절 현미경 무대에서 성장하고 있습니다. 5 분마다, 세포 내 형광 분자 (이상 공동 이미징 아르) 형광 이미지를 분석하여 unted 만 새로 번역 된 단백질이 다음 측정에 포함됩니다 있도록 이후 photobleached.
이 방법에 의한 형광 이미지는 각 이미지의 형광 명소를 감지 개별 셀에 지정하고 세포 lineages에 셀을 지정하여 분석 할 수 있습니다. 주어진 셀에 시간 창 내에서 생산되는 단백질의 수는 단일 형광 분자의 평균 강도에 의해 장소의 통합 형광 강도를 나누어 계산됩니다. 우리는 하나의 5 분 시간 창에서 0-45 분자의 범위에서 표현 수준을 측정 할 수이 방법을 사용했습니다. 이 방법은 우리가 λ 억제 CI의 표현에 소음을 측정 할 수있게하고, 시스템 생물학에 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다.
프로토콜
1. 스트레인 엔지니어링 워크 플로우
- 시퀀스 인코딩 (A) 막 현지화 순서, (b)는 빠른 속도로 성장하고 형광 단백질과와 관심 단백질 (예를 들어 전사 인자)와 프레임 (C) 단백 분해 효소 인식 서열 N-터미널.를 삽입 우리는 TSR-비너스 기자 대상 멤브레인을 사용하고 표현 박테리오파지 λ 억제 CI 단백질 분자의 수를 계산하기 위해 Ubiquitin 단백 분해 효소 인식 서열 (UB)에 융합. 우리가 지역을 코딩 CI 야생 형을 대체하고 E.에 구조를 통합, 융합 단백질 TSR-비너스-UB-CI를 구축 방법에 대한 자세한 내용은 λ 레드 재조합 3을 사용 대장균의 염색체가, 심판에 자세히 설명되어 있습니다. 1.
- 시퀀싱하여 모든 수정 사항을 확인합니다.
- 플라스미드 인코딩 할 관심의 형광 기자와 단백질을 표현 변종에 위의 사용 된 인식 순서에 맞는 프로테아제를 변환병진 융합 인치 우리는 C-터미널 Ubiquitin 잔류 네 직후 cleaves 단백 분해 효소 Ubp1을 사용 하였다.
2. 문화 셀 및 샘플 준비
- 한 E. 선택 갓....
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결과
λ 억제 CI의 생산을 추적 CoTrAC 실험에서 전형적인 결과는 그림 4와 5에 표시됩니다. 이 실험에서, 12 콜로니는 5 분 간격으로 이미징했다. 때마다 시점에서, 식민지 먼저 autofocused되었고 이미징 영역 내에 중앙. 다음으로 중심 / 중심의 위치가 저장되었고 brightfield 이미지가 인수되었습니다. 무대는 다음 세포를 (위상 대비 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 광학없이 bisecting 비행기에 brightfield 초점 평면에서 이동하려면 Z-축을 따라 ~ 0.5 μm에 의해 translocated되었습니다 반투명 개체는 약간의 이미징 할 수 있습니다 밖에서 초점 비행기 8). 마지막으로, 여섯, 이미지는 100 밀리 초 노출 (그림 5는 하나의 시점을 보여줍니다)을 1 초 간격, 각에 인수되었다. 이것은 각각의 시점에서 모든 셀에 대해 반복되었다. 거의 모든 비너스 분자는 각 timepoint, fluores에서 pho.......
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토론
CoTrAC 방법은 기존 N 또는 C-터미널 형광 단백질 fusions 단백질의 활동을 방해하는 다른 단백질의 생산을 측정하는 일반화 할 수 있습니다. CoTrAC 전략은 현재의 방법으로 세 독특한 장점이 있습니다. 첫째, 공동 병진 융합 형광 기자 분자가 실시간으로 단백질 생산의 정확한 계산을 허용, 관심있는 단백질의 각 분자에 대한 생산 될 수 있도록합니다. 둘째, 막 타겟 기자는 TSR-금성은 매우 낮은 수준에서 표현 단백질의 검출을 사용, 형광 기자의 단일 분자 검출 할 수 있습니다. 가장 중요한 세 번째와 네, 형광 기자의 공동 병진 절단 관심의 단백질은 E.의 단백 분해 효소 인식 순서로 Ubiquitin 일반적으로 - 사용하여 가까운 야생 형 시퀀스와 기능을 유지 할 수 있습니다 대장균은 대상 단백질은 그 첫 번째 N-터미널 N에서 자신의 야생 형 펩타이드 시퀀스 다를 </ EM> - 포르 밀 메티오닌 - 메티오닌은으로 변경됩니다.
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공개 사항
우리는 공개가 없습니다.
감사의 글
Ubp1을 표현 플라스미드 pCG001께서는 의학 연구의 존 커틴 대학에서 로한은 베이커에 의해 제공되었다. 이 작품은 천 연구 기금 1 FY2011 년 3 월, 천 바질 오코너 초보자 학술 연구 상 # 5 - FY20 및 NSF 경력 상 0,746,796 3 월에 자금을 지원했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 (선택 사항) |
| 아가로 오스 (낮은 녹는 온도) | Lonza | 50,100 | |
| 밀리 Q H 2 O | |||
| 5 × M9 소금 | 다음 제조법은 9에 설명 | ||
| 20 % 포도당 | |||
| MgSO 4 | |||
| CaCl 2 | |||
| 50 × 가상 아미노산 솔루션 | Invitrogen | 11130-051 | |
| 온도 조절 성장방 무대 어댑터 | Bioptechs | FCS-2 | |
| 목표 히터 | Bioptechs | 모델 현미경 대물에 따라 달라집니다 | |
| 슬라이드 Microaqueduct | Bioptechs | 130119-5 | |
| 마이크로 커버 유리 | VWR | 40CIR-1 | 소스에 어려울 수 있습니다, Bioptechs의 이용도 가능합니다 |
| 유리 / 슬라이드 근육 커버 | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| 형광 현미경 | 여러 | 예를 들어 설정 : 코 히어 런트 Innova 308C 아르곤 이온 레이저, 올림푸스 IX-81 현미경, 올림푸스 PlanApo 100X NA 1.45 목적, Metamorph 소프트웨어 | 레이저 여기, 자동화 XYZ 단계, 스크립트 이미징 및 자동 초점이 가능 자동화 소프트웨어 resolvin 할 수있는 광학이 있어야합니다g 단일 형광 단백질 |
| EM-CCD 카메라 | 여러 | 예를 들어 설정 : ANDOR Ixon DU-898 | 배경 위의 하나의 형광 단백질을 감지 충분히 낮은 소음을 가지고 있어야 |
참고문헌
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S.
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