개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한 프로토콜 Drosophila oocytes가 설명되어 있습니다.
이 논문에서
요약
초록
Drosophila의 난 모세포는 같은 cytoskeletal 기능, 세포 조직 및 세포 기관의 구조와 기능 등의 근본적인 질문에 대해 조사를위한 다양한 시스템으로 설립되었습니다. 다양한 GFP 태그 단백질의 가용성은 여러 세포 프로세스가 몇 분, 아님 몇 시간의 과정을 통해 세포를 사는,이 기술을 사용하여 모니터링 할 수 있다는 것을 의미합니다, 이러한 RNP 교통, 상피 morphogenesis 및 조직 리모델링과 같은 프로세스는 훌륭한 자세히 설명되어 Drosophila의 oocytes의 1,2 인치
돌연변이의 풍부한 레퍼토리와 함께 비디오 이미징을 수행 할 수있는 능력은 유전자 및 프로세스의 거대한 다양한 종류의 놀라운 세부 사항에서 검토 할 수 있습니다. 하나의 예는 중간 oogenesis 3,4에서 시작 ooplasmic 스트리밍의 과정입니다. 세포질 소포의 활발한 움직임은 미세 소관과 kinesin 종속적 인 5 및 유용한 치세요을 제공합니다이 단계에서 세포 골격 기능을 조사하는 TEM.
난 여기 거의 모든 공 촛점 현미경 설정을 사용하여 생활 oocytes의 시간 경과 영상을위한 프로토콜을 제시한다.
프로토콜
1. 해부를위한 파리 준비
- 이전보다 일주하는 원하는 유전자형 (예를 들어, GFP-라벨 단백질을 표현)의 건강 파리를 마취. 둥근 크림색 abdomens으로 10-15 대 여성을 선택합니다.
- 새로운 가볍게 yeasted 음식을 포함하는 유리 병에 선택한 파리와 몇 가지 (3-5) 남성을 송금 파리 25 ° C.에서 이틀 동안 살찌 울 수 Drosophila 준비에 대한 자세한 내용은 Weil 외 6.를 참조하십시오. 대비해 한참 지방을 축적 파리 단계의 다양한, 특히 단계 8-12은 이미지에 사용할 수 있도록합니다. 제대로 살 찌우는 또는 unfattened하는 것이 매우 초기 단계 (1-6)과 성숙 (무대 14) oocytes를 포함 이동합니다.
2. 입식 복합 현미경을 사용하여 이미징을위한 Oocytes의 작성
- 실리콘 그리이스를 사용하여 약 1cm 간격의 슬라이드에 두 coverslips을 affixing하여 표준 유리 슬라이드를 준비5. 만 coverslip 및 슬라이드 사이 좋은 도장을 보장하기 위해 충분한 기름을 사용합니다. 각 coverslip에 단단히 아래로 누르면 얇게하고 균일하게 기름을 전파합니다. coverslips 및 슬라이드 사이의 시점에 일부 할로 카본 오일에게 27 일 (시그마)를 추가합니다. 그들은 다음 단계로 분리 oocytes의 손상 방지하기 위해 스페이서 역할을합니다. 번호 1.5 coverslips 늦게 무대 oocytes의 것이 일치하는 평균 두께 (0.16-0.18 mm)로 잘 작동합니다.
- 22mm 2 coverslip의 표면에 장소 할로 카본 오일 27로부터 2-3 방울을. 가능한 가장 건강 oocytes를 구하려면 개인 여자는 입 pipetting을 사용하여 식품 유리 병에서 제거하고 부드럽게 첫번째 anesthetizing없이 할로 카본 오일로 입금됩니다.
- 날카로운 해부 포셉 (예 : 뒤몽 # 5)를 사용하여 coverslip에 대한 플라이를 핀과 복부의 끝을 당겨. 기름 아래에있는 coverslip의 표면을 따라 드래그하여 난소를 제거합니다. 이 adhesio을 촉진합니다N coverslip에 oocytes의.
- 부드럽게 oogenesis 중 적어도 무대 10B 아르 oocytes를 찾고, 난소를 분리 애타게. 이 단계에서 Oocytes는 난 모세포가 난자 챔버의 전체 볼륨의 최소 50~60%를 차지하고있는 계란 챔버를 찾아 식별 할 수 있습니다. 이 시점 oogenesis의에서, 난 모세포 놓인 소낭 세포는 원주가 있으며, 간호사 세포에 대한 연결이 남아 작은 지역을 제외한 모든면에서 난 모세포를 둘러싸고 있습니다. ovariole 칼집에서 개별 oocytes을 제거 포셉을 사용합니다.
- 5-8 큰 피해를 oocytes가 coverslip에 격리 될 때까지, 1-3 여성을 사용하여 진행합니다. 모든 unuseable 조직을 제거합니다.
- 조심스럽게 oocytes가 두 스페이서 사이에 위치되도록 사전 준비를 슬라이드에 oocytes가 포함 된 coverslip을 반전. 그 oocytes를 손상시킬 수로 역 coverslip에 눌러하지 마십시오. 필요한 경우, t에 할로 카본 오일의 작은 금액을 추가"샌드위치"의 그 가장자리 공간 확보를 보장하기위한 가득 차 있습니다. (옵션 :. coverslip의 정착이 가능하도록하기 위해서 몇 분 동안 슬라이드 나머지를 보자) 슬라이드는 이제 이미지에 대한 준비가되었습니다.
3. 역 복합 현미경을 사용하여 이미징을위한 Oocytes의 작성
- Oocytes 대신 coverslips의 사용이 유리 하단 삽입 (MatTek 35 ㎜)과 그 작은 페트리 요리를 제외하고 기본적으로 2 절에서 설명 해부 있습니다. 이 표본을 충당 할 필요가 있으며, 절개 후 조직은 요리에 직접 이미징 될 수 있지만, 치료가 oocytes 기름으로 덮여 들어갔다 건조 할 수 없습니다 유지하기 위해주의해야합니다.
4. 영상 라이브
- DIC 또는 위상 대비 광학을 사용하여 초점에 난 모세포를 가져와 같은 세포질의 누출, 또는 소낭 세포의 불룩 등의 손상의 징후가 난 모세포을 확인합니다. 건강하고 큰 피해가 표시 이미지 만 oocytes.
- Strea세포질에 난황의 소포는 7 autofluorescent 때문에 명나라는 GFP 라벨 필요없이 직접 모니터링 할 수 있습니다. 이 신호는 범위의 FITC 범위에서 캡처 할 수 있지만 가능성이 GFP-라벨 단백질에 사용되는보다 높은 게인 설정이 필요합니다.
- 스트리밍의 가장 좋은 이미지는 단지 유리 coverslip / 페트리 유리에 대해 쉬고 난 모세포의 표면 이하의 광학 섹션에서 얻을 수 있습니다. 다음은 난 모세포가 약간 초점이 더 나은 비행기를 만들고 평평하게되어 있습니다. 이미지는 200X에서 캡처 할 수 - 1,000 X. coverslip의 난 모세포와 목표 사이에 장벽을 형성부터 배열을 사용하면 여기에 설명 된, 공기의 목표는 사용해야합니다. 가 크게 샘플의 드리프트와 움직임을 최소화하기 때문에 최적입니다.
- 관심 지역 초점이되면 brighfield 광학을 해제하고 공 촛점 이미징로 전환합니다. 소프트웨어의 빠른 검색 / 미리보기 기능을 사용하여 초점을 조정하고 얻을 수필요에 따라.
- 캡처를위한 설정 현미경의 현미경을 다를 수 있지만, 일반적으로 매개 변수는 다음과 같습니다 ~ 488 nm의 여기 파장과 ~ 515 nm의 방출 파장을 사용합니다. Z-축 Z 축 프레임 사이의 10 초를 지연으로 일정하게 유지되도록 캡처 설정합니다. 난 모세포는 고정하고 초점 비행기가 적절한 보장하기 위해 5-10 프레임의 테스트 시퀀스를 캡처합니다.
- 전형적인 시간 경과 순서는 20 사이에 캡처됩니다 - 50 프레임, 및 비디오 품질을 평가하는 종료 후 즉시 확인 할 수 있습니다. 과정은 슬라이드에있는 다른 세포에 대해 반복 할 수 있습니다, 또는 필요에 따라 추가 여성은 해부 할 수 있습니다.
5. 문제 해결 및 일반적인 문제
- 드리프트 - 수직 현미경을 사용하는 경우, 전지는 때때로 인해 기름의 확산에 표류 할 수 있습니다. 이것은 coverslip 아래 영역을 커버 만 충분한 오일을 사용하여 최소화 할 수 있습니다. 문제가 계속되면, 더 적은 실리콘 g를 사용하여슬라이드에 부착 스페이서에 rease.
참고 : 일부 공 촛점 소프트웨어 패키지가 셀 추적 할 수 있지만, 일반적으로는 떠도는 oocytes의 이미지를 포기하고 대신 다른 표본을 사용하는 것이 좋습니다.
- 더 스트리밍의 흔적 - 스트리밍이 분명하지 않은 경우가 주로 두 원인 중 하나 일 수 있습니다, 두 이미지 캡처에 대한 초점 평면이 정확하지 않습니다 (보통 난 모세포의 내부에 너무 깊이) 또는 난 모세포가 손상되었습니다. 시간과 연습은 모두 오류를 최소화 할 수 있습니다.
결과
GFP-분류 단백질의 영상은 태그 단백질이 표현되는 방식을 강하게에 따라 달라집니다. reticulon은과 같은 1 (Rtnl-1), 엑손은 GFP 8,9 태그를 표현하는 중간 단계 난 모세포는 강력한 신호를 생성한다. Rtnl-1에 나타납니다 10 ooplasmic 스트리밍 (그림 1A) 동안 현재의 긴 미소와 함께 공동 현지화. Rtnl-1 스트리밍을 관찰하기에 좋은 표시입니다, 또한 늦은 무대 oocytes의 미세 소관 기관의 지표입니다.
한 프레임의 캡쳐 속도마다 10 초 (그림 1B)를 사용할 때 wildtype 달걀 챔버에서 Ooplasmic 스트리밍은 autofluorescent 난황의 소포의 눈에 띄는 움직임으로 분명하다. 다섯 프레임의 최대 돌출부는 이동 소포의 경로를 표시 생성 할 수 있습니다.
1 그림. autofl 모두의 영상을 라이브uorescent와 GFP 태그 구조. 400 배로 확대 한 Rtnl1-GFP를 표현 무대 11 난 모세포의 A) 하나의 시간 경과 이미지입니다. Rtnl1-GFP 섬유는 스트리밍 oocytes의 파도와 같은 모션으로 이동합니다. autofluorescent 난황의 소포가 400 배로 확대 한 확대, 50 초 총마다 10 초를 이미지로 된에 무대 10B 계란 챔버의 B)는 5 프레임 최대 프로젝션입니다. 스케일 바 = 30 μm
토론
Drosophila의 oocytes는 세포와 subcellular 구성 요소의 기능과 조직에 관한 질문의 다양한 해결을 위해 다양한 모델 시스템입니다. 단백질 기능의 전체 이해 단백질 행동 모두 공간과 시간적 측면의 모니터링이 필요합니다. Drosophilists 사용할 수 이미징 시스템과 유전 도구 모두에서 진보는 가능도 작은 실험실 생활 oocytes에서 고품질의 영상 실험을 수행 할 수 있도록. 난 여기 단백질 기능을 조사하기 위해 유전 배경을 다양한와 함께 사용할 수있는 늦은 oogenesis 중순에하는 동안 GFP-태그 또는 autofluorescent 단백질과 구조의 동작을 분석 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.
이 프로토콜에서 나는 oocytes는 이미징 및 형광 단백질과 구조의 시간 경과 영상 취득이 활성화됩니다 기본 공 촛점 설정을 위해 준비하는 과정을 설명합니다. 추가 detai난 모세포 준비에이게는 Weil 외 의해 설명되어 있습니다. 6 다양한 endogenously 엑손 - 트래핑를 통해 태그 된 단백질을 표현 플라이 변종 8 이용하실 수 있으며, 무한 더 많은 단백질 변형이 설계 및 파리에 다시 제출 할 수 있습니다.
생활 조직과 협력에서, 표본의 건강은 가장 중요한 중요합니다. 무대 10B에서 알 챔버는 단기 이미징 연구에 이상적입니다, 기본적으로 자율적 인 방식으로 11 oogenesis을 완료 할 수 있습니다. 케어는 고품질의 데이터를 얻을 수 몇 가지 주요 단계에서 촬영해야합니다. 해부하는 동안은 가능한 한 작은으로 난소와 oocytes를 조작하고, 해부 및 이미징의 완료 사이의 시간의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 이상적으로, 작은 절개 역은 공 촛점 범위를 소장 같은 방에 있어야하고, 한 번에 몇 계란 챔버는 이미징해야합니다. 번호 (5-8 여기에 권장) 좋은 품질의 이미지를 얻을 가능성을 극대화 해부 시간이 최소화 될 수 있도록합니다. I 이미지 품질을 평가하고 캡처 설정이 더 이상 시간 경과 순서를 캡처하기 전에 최적화되어 있는지 확인 이미지의 짧은 시리즈를 캡처하는 것이 좋습니다. 대부분의 소프트웨어는 개별 프레임을 저장할 수 있으며, 이러한 이미지는 다음 ImageJ 12 다른 소프트웨어를 사용하여 다양한 방법으로 분석 할 수 있습니다.
공개 사항
나는 공개 할 아무 것도 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 지역 프로그램에서 보조금 GM096076에 의해 지원되었다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 할로 카본 오일 27 | 시그마 - 알드리치 | H8773-100ML | |
| # 5SF 집게 | 정밀 과학 도구 | 11252-00 | |
| 실리콘 그리스 | 시그마 알드리치 | Z273554 - 1EA | |
| 유리 바닥 배양 접시 | MatTek | P35G-0-20-C |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
