التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D
Summary
الالتهام الذاتي هو عملية في كل مكان التي تمكن الخلايا تتحلل وإعادة تدوير البروتينات والعضيات. نحن نطبق المجهري مضان متقدمة لتصور وقياس صغيرة، ولكن التغييرات الأساسية، المادية المرتبطة تحريض الالتهام الذاتي، بما في ذلك تشكيل وتوزيع autophagosomes والجسيمات الحالة، والانصهار بهم إلى autolysosomes.
Abstract
سرطان البروستاتا هو الشكل الرائدة في مجال الأورام الخبيثة بين الرجال في الولايات المتحدة، بينما جراحة يحمل مخاطر كبيرة من العجز الجنسي وسلس البول، وقد كان النهج العلاج الكيميائي التقليدي غير ناجحة إلى حد كبير. العلاج الهرموني فعال في مرحلة مبكرة، ولكن غالبا ما يفشل مع التنمية في نهاية المطاف من الأورام هرمون الحرارية. لقد تم مهتمة في تطوير علاجات تستهدف نقص التمثيل الغذائي محددة من الخلايا السرطانية. أظهرنا مؤخرا أن الخلايا السرطانية تفتقر البروستاتا على وجه التحديد انزيم (سينسيز أرجينينوسكسينات، أو ASS) تشارك في تركيب الأحماض الأمينية أرجينين 1. هذا الشرط يسبب الخلايا السرطانية لتصبح تعتمد على أرجينين الخارجية، وأنها تخضع الإجهاد الأيضي عندما يتم استنفاد أرجينين مجانا من أرجينين deiminase (ADI) 1،10. في الواقع، ونحن قد أظهرت أن خلايا سرطان البروستاتا البشرية CWR22 RV1 يتعرضون للقتل على نحو فعال من قبل ADI مع موت الخلايا المبرمج كاسباس مستقلة وautopha العدوانيةغراي (أو macroautophagy) 1،2،3. الالتهام الذاتي هو عملية تطويريا-الحفظ التي تسمح الخلايا على استقلاب البروتينات غير المرغوب فيها من قبل انهيار الليزوزومية خلال المجاعة الغذائية 4،5. على الرغم من أن المكونات الأساسية لهذا المسار جيدا يتميز 6،7،8،9، العديد من جوانب الآلية الجزيئية لا تزال غير واضحة – على وجه الخصوص، ما هو دور الالتهام الذاتي في وفاة والاستجابة من خلايا سرطان البروستاتا بعد العلاج ADI ؟ من أجل معالجة هذه المسألة، ونحن يتطلب المنهج التجريبي لقياس مستوى ومدى استجابة autophagic في الخلايا – وبما أنه لا توجد الواسمات الجزيئية المعروفة التي يمكن أن تتبع بدقة هذه العملية، اخترنا لتطوير نهج قائم على التصوير، وذلك باستخدام الكمية المجهري مضان 3D 11،12.
باستخدام CWR22Rv1 الخلايا على وجه التحديد المسمى مع تحقيقات الفلورسنت لautophagosomes والجسيمات الحالة، وتبين لنا أن مداخن صورة 3D المكتسبة مع أي وايdefield المجهر deconvolution (وفيما بعد، مع فائق الدقة، المجهري منظم في الإضاءة) يمكن التقاط بوضوح المراحل المبكرة من تحريض الالتهام الذاتي. مع المتاحة تجاريا تطبيقات تحليل الصور الرقمية، ويمكننا الحصول بسهولة على معلومات إحصائية عن عدد جسيم بلعمي ذاتي ويحلول والحجم والتوزيع، ودرجة colocalization من أي خلية المصورة. هذه المعلومات يسمح لنا لتتبع بدقة التقدم من الالتهام الذاتي في الخلايا الحية، ويمكن استمرار تحقيقاتنا في دور الالتهام الذاتي في العلاج الكيميائي للسرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن الملاحظة المباشرة من الخلايا المسمى مع تحقيقات الفلورسنت ضد LC3 مقبولة على نطاق واسع كوسيلة القياسية لتأكيد استجابة autophagic 6، والتصوير 3D الكمي من النظام نفسه (كما فعلنا) يقدم معلومات غير مسبوقة والتفاصيل حول عملية معقدة من الالتهام الذاتي الخلوي . على وج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدعم المنحة: المعاهد الوطنية للصحة CA165263، المعاهد الوطنية للصحة CA150197، المعاهد الوطنية للصحة CA150197S1 (HJ الكونغ)، NIH CA150197S1 (CA Changou)، NSF PHY-0120999 مركز بيوفوتونيك علوم والتكنولوجيا (DL ولفسون، FYS تشوانغ)، وزارة الدفاع PC073420 (RJ بولد)، والبحوث مجلس النرويج، ييف ايريكسون السفر جرانت 209286/F11 (BS أهلواليا). كما يقر HJ الكونغ بدعم من صندوق أوبورن السرطان جماعة الوقف. كما يقر RJ بولد بدعم من جون ماكدونالد الوقف.
نشكر الدكتور جيني وي جين الكونغ والدكتور بوروسيا ون وو في DesigneRx لتوريد سخية من ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
