Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie
Summary
Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.
Abstract
Prostaatkanker is de toonaangevende vorm van maligniteiten bij mannen in de VS Terwijl chirurgie draagt een significant risico op impotentie en incontinentie, hebben traditionele chemotherapeutische benaderingen grotendeels in het ongelijk gesteld. Hormoontherapie effectief is in een vroeg stadium, maar vaak mislukt met de uiteindelijke ontwikkeling van hormoon-refractaire tumoren. Wij zijn geïnteresseerd in het ontwikkelen van therapieën gericht op specifieke metabole deficiëntie van tumorcellen. We hebben onlangs aangetoond dat prostate tumorcellen specifiek missen een enzym (argininosuccinate synthase of ASS) betrokken bij de synthese van het aminozuur arginine 1. Deze voorwaarde zorgt ervoor dat de tumorcellen afhankelijk van exogene arginine te worden, en ze ondergaan metabole stress toen de vrije arginine wordt uitgeput door arginine deiminase (ADI) 1,10. We hebben inderdaad aangetoond dat het menselijke prostaatkankercellen CWR22 RV1 doeltreffend worden gedood door ADI met caspase-onafhankelijke apoptose en agressieve autophagy (of macroautofagie) 1,2,3. Autophagy is een evolutionair geconserveerde proces waarmee cellen om ongewenste eiwitten metaboliseren door lysosomale afbraak tijdens voedingswaarde verhongering 4,5. Hoewel de essentiële onderdelen van deze route zijn goed gekarakteriseerd 6,7,8,9, vele aspecten van het moleculaire mechanisme nog onduidelijk zijn – in het bijzonder, wat is de rol van autofagie in de dood-respons van prostaatkankercellen na ADI behandeling ? Om deze vraag te beantwoorden hebben we nodig een experimentele methode om het niveau en de mate van autophagic respons in cellen te meten – en omdat er geen bekende moleculaire merkers die nauwkeurig deze taak kan volgen, kozen we een imaging-gebaseerde aanpak, met kwantitatieve 3D fluorescentiemicroscopie 11,12.
Met behulp CWR22Rv1 cellen specifiek gelabeld met fluorescerende probes voor autofagosomen en lysosomen, laten we zien dat 3D-beeld stacks opgenomen met ofwel widefield deconvolutie microscopie (en later, met super-resolutie, gestructureerde-verlichting microscopie) kan de vroege stadia van autofagie inductie duidelijk vast te leggen. Met commercieel verkrijgbare digitale beeldanalyse-toepassingen, kunnen we gemakkelijk statistische informatie over autophagosome en lysosome aantal, de grootte, de distributie, en de mate van colocalization vanaf elke afgebeelde cel krijgen. Deze informatie stelt ons in staat om de voortgang van autofagie in levende cellen nauwkeurig te volgen en stelt onze voortdurende onderzoek naar de rol van autofagie in chemotherapie bij kanker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl de directe waarneming van cellen gelabeld met fluorescerende probes tegen LC3 wordt algemeen aanvaard als een standaard methode om autofagocytische respons 6, kwantitatieve 3D beeldvorming van hetzelfde systeem (zoals wij gedaan hebben) biedt ongekende informatie en details over het complexe proces van cellulaire autofagie bevestigen . In het bijzonder zien we dat honderden (zo niet duizenden) van autofagosomen in levende cellen worden gevormd binnen 80 min van autofagie inductie. Ook zien we zeer int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant ondersteuning: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Centrum voor Biophotonics Wetenschap & Technologie (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Vet), The Research Raad van Noorwegen, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkent ook de steun van de Auburn Gemeenschap Cancer Endowment Fund. RJ Vet erkent ook de steun van de J. McDonald schenking.
Wij danken dr. Jenny Wei-Jen Kung en Dr Bor-wen Wu bij DesigneRx voor genereuze aanbod van de ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
