Analyse quantitative de l'autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D
Summary
L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.
Abstract
Cancer de la prostate est le plus grand sous forme de tumeurs malignes chez les hommes aux Etats-Unis Alors que la chirurgie comporte un risque important de l'impuissance et l'incontinence, les approches chimiothérapeutiques classiques ont largement échoué. L'hormonothérapie est efficace à un stade précoce, mais échoue souvent avec le développement éventuel de tumeurs hormono-réfractaires. Nous sommes intéressés à développer des produits thérapeutiques ciblant déficience métabolique spécifique des cellules tumorales. Nous avons récemment montré que les cellules tumorales de la prostate n'ont pas spécifiquement une enzyme (synthase argininosuccinate ou ASS) impliquée dans la synthèse de l'arginine 1 acide aminé. Cette condition provoque les cellules tumorales de devenir dépendant de l'arginine exogène, et ils subissent un stress métabolique lorsque arginine libre est épuisée par l'arginine déiminase (DJA) de 1,10. En effet, nous avons montré que les cellules cancéreuses de la prostate de l'homme CWR22 Rv1 sont effectivement tués par ADI à l'apoptose caspase-indépendante et autopha agressifgy (ou macroautophagie) 1,2,3. L'autophagie est un processus évolutif conservée qui permet aux cellules à métaboliser les protéines indésirables par répartition lysosomale durant la famine nutritionnel 4,5. Bien que les composantes essentielles de cette voie sont bien caractérisés 6,7,8,9, de nombreux aspects du mécanisme moléculaire sont encore mal connues – en particulier, quel est le rôle de l'autophagie dans la mort-réponse des cellules cancéreuses de la prostate après traitement ADI ? Afin de répondre à cette question, nous avons demandé une méthode expérimentale pour mesurer le niveau et l'ampleur de la réponse autophagie dans les cellules – et puisqu'il n'y a pas de marqueurs moléculaires connues qui peuvent suivre avec précision ce processus, nous avons choisi de développer une approche basée sur l'imagerie, à l'aide la microscopie à fluorescence 3D quantitative 11,12.
Utiliser CWR22Rv1 spécifiquement les cellules marquées avec des sondes fluorescentes pour autophagosomes et des lysosomes, nous montrons que les piles d'images 3D acquises soit avec wimicroscopie à déconvolution defield (et plus tard, avec des super-résolution, microscopie structuré-illumination) peut capturer clairement les premiers stades de l'induction autophagie. Avec des applications d'analyse d'images numériques disponibles dans le commerce, nous pouvons facilement obtenir des informations statistiques sur nombre autophagosome et lysosome, la taille, la distribution, et le degré de colocalisation de n'importe quelle cellule imagé. Cette information nous permet de suivre précisément l'évolution de l'autophagie dans les cellules vivantes et permet à notre enquête continue sur le rôle de l'autophagie dans la chimiothérapie du cancer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que l'observation directe des cellules marquées avec des sondes fluorescentes contre LC3 est largement acceptée comme une méthode standard pour confirmer la réponse autophagic 6, l'imagerie 3D quantitative du même système (comme nous l'avons fait) fournit des informations sans précédent et les détails sur le processus complexe de l'autophagie cellulaire . En particulier, nous observons que des centaines (voire des milliers) de autophagosomes dans les cellules vivantes sont formé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les subventions: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Centre pour la biophotonique Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Gras), les recherches Conseil de la Norvège, Leiv Eiriksson Travel Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung reconnaît également le soutien du Fonds Auburn Communauté Cancer dotation. RJ Gras reconnaît également le soutien de l'J. McDonald dotation.
Nous remercions le Dr Jenny Wei-Jen Kung et le Dr Bor-wen Wu à DesigneRx pour l'approvisionnement généreux de l'ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
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